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       【摘要】 
       目的优选香附总黄酮的提取工艺。方法采用回流提取法，以香附总黄酮的含量为评价指标，以乙醇浓度、提取时间、提取次数为考察因素，采用正交实验优选香附总黄酮的提取工艺。结果优化的提取条件为60%乙醇，80℃提取2次，3h/次。结论优化的提取工艺可为香附总黄酮的进一步研究提供基础。
       【关键词】  正交实验; 香附; 总黄酮; 提取工艺
       香附为莎草科植物莎草Rhizoma cyperi rotundus L.的干燥根茎，主产于山东、浙江等地，有行气解郁，调经止痛的功效，常用于治疗肝郁气滞，胸、胁、脘腹胀痛，消化不良，胸脘痞闷，寒疝腹痛，乳房胀痛，月经不调，经闭痛经[1]，被历代中医誉为“气病之总司，女科之元帅” [2] 。香附中主要成分为挥发油类，另外，文献报道还有黄酮类、三萜类、糖类、生物碱类、酚类和萜类等[3]。文献报道香附水提物具有较强的镇痛作用[4]，因此，对香附挥发油以外成分的深入研究对于揭示香附广泛的药理作用是十分有必要的。
       近年来，黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐。该类化合物能防治心脑血管系统疾病和呼吸系统疾病，具有抗菌抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗衰老和增强免疫力等药理作用[5]。香附为临床常用药，有关香附黄酮类成分的研究报道较少，本文对香附总黄酮提取工艺进行了研究，旨在为香附的进一步开发奠定基础。
       1 材料与仪器
       UV-265FW紫外可见分光光度计(日本岛津)，LC-3501超声波中药处理机(济宁市中区鲁超仪器厂)，XS205DU电子天平(上海梅特勒-托里多仪器有限公司)。芦丁对照品(购于中国药品生物制品鉴定所 批号10008-200306 )，香附药材,购于山东泰安, 经山东省中医药研究院李英霞副研究员鉴定为莎草Rhizoma cyperi rotundus L.的干燥根茎。石油醚、三氯甲烷、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 正交实验设计在预试的基础上采用乙醇回流提取法，选择主要影响提取效率的乙醇浓度(A)，提取时间(B)，提取次数(C)为考察因素，以提取物中香附总黄酮的含量为考察指标，采用L9(34)正交表进行实验,因素水平表见表1。表1 因素水平
       2.2 样品处理取香附粉末2份(过20目)，每份8 g，分别放入滤纸筒中，加80 ml石油醚(30～60℃)于索式提取器中，脱脂3h，弃石油醚。纸包挥干溶媒后，无香附挥发油气味，即得脱脂香附粉末。
       2.3 总黄酮含量测定
       2.3.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品10 mg，置100 ml容量瓶中，加95%的乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀作为储备液。精密量取储备液4 ml，置10 ml容量瓶中，95%乙醇定容，摇匀,做为对照品溶液。
       2.3.2 供试品溶液的制备精密称取脱脂后的香附粉末1 g，置烧瓶中，加入60%乙醇20 ml，80℃水浴回流提取2次，3 h/次,放冷，过滤，滤液蒸干，甲醇溶解定容于25 ml容量瓶中，摇匀，作为香附供试品溶液。
       2.3.3 波长的选择取对照品溶液1 ml,供试品溶液2 ml，在5%亚硝酸钠溶液0.3 ml存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液，在495～506 nm波长范围内测定络合物的吸光度，结果对照品与样品均在500 nm左右处有最大吸收，故测定时选用此波长。
       2.3.4 线性关系考察精密量取芦丁对照液(0.10 mg/ml)0.3，0.5，1，2，3，4，5 ml分别置于10 ml容量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.3 ml，摇匀，静置6 min，再加10%的硝酸铝0.3 ml，摇匀，静置6 min，再加4%的氢氧化钠4 ml，用水稀释至刻度，摇匀，静置12 min。以试剂作为空白参比液，于500 nm波长处测吸光度。以浓度(C)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，得回归方程为：A=0.084 7C-0.004 8，相关系数r=0.999 8。实验结果表明，芦丁在3.0～50.0μg/ml范围内线性关系良好。标准曲线见图1。图1 芦丁对照品标准曲线图
       2.3.5 样品测定取脱脂后的香附粉末约1 g，按正交实验设计表中的要求，加一定浓度乙醇20 ml，提取一定时间及次数，80℃水浴提取，放冷，过滤，蒸干，以甲醇溶解，过滤到25 ml容量瓶中，取2 ml到10 ml容量瓶中，按“2.3.4”项下测吸光度，计算香附总黄酮含量，进行方差分析,结果见表2～3。经直观分析和方差分析可见，影响香附总黄酮提取的因素大小顺序为A>B>C，乙醇浓度为主要影响因素，提取时间和提取次数为次要影响因素。对于A因素，K3>K2>K1 ，水平3为最优，即乙醇浓度为60%。对于B因素，K3>K2>K1,水平3为最优，即选提取时间为3 h。对于C因素，K3>K2>K1 ，因C因素对于测定结果影响很小，从提取效率和节约时间等方面综合考虑，选取次数为2次，因此，确定香附总黄酮最佳提取工艺条件为A3B3C2 ，即60%的乙醇，80℃提取2次，3 h/次。表2 L9(34)正交实验计划表及结果表3 方差分析结果上述优选工艺的重复性，按优选条件重复进行3次试验，(见表4)。由表4可以看出，香附总黄酮的提取工艺是稳定可行的。表4 验证性实验结果
       3 讨论
       3.1 提取方式的选择香附中黄酮类化合物一般采用极性较大的溶剂进行提取如甲醇、乙醇等，作者选择了乙醇为提取溶媒,文献报道[6] 采用超声法提取,作者对超声法与回流法进行了比较,结果超声法总黄酮含量为0.80%,而回流法为1.20%,回流法优于超声法,因此,作者采用回流法提取。
       3.2 样品前处理方法的选择香附不经脱脂直接提取后，加5%亚硝酸钠和10%的硝酸铝及4%的氢氧化钠显色时，会产生红色絮状沉淀,影响吸光度的测定，致使测定的香附总黄酮含量产生误差。而将香附以石油醚脱脂后，再以乙醇提取，显色时无沉淀产生，推测沉淀为香附中挥发油所致，因此，测定香附总黄酮时首先对样品进行了脱脂处理。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：181.
       
       [2] 明·李时珍.本草纲目(校点本上册) [M].北京：人民卫生出版社，1982：888.
       
       [3] 黄险峰，彭国平.香附的化学成分及药理研究进展[J].中药材，2003，26(1):65.
       
       [4] 欧润妹，邓远辉，李伟英，等.香附不同溶剂提取物解热镇痛效应的比较[J].山东中医杂志，2004，23(12)：740.
       
       [5] 黄爱玲. 黄酮类化合物药理作用研究进展[J]. 安徽农学通报, 2007，13(10): 71.
       
       [6] 黄锁义，罗建华，张丽丹，等.香附总黄酮的超声波提取工艺研究[J] 时珍国医国药，2008，19(1)：141.