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       【摘要】 
       目的观察赤芍总苷对小鼠胆汁淤积型肝损伤的保护作用。方法ICR小鼠72只，随机分为正常对照组，模型对照组，赤芍总苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性药(赤丹退黄颗粒)对照组;各治疗组小鼠连续6 d灌胃给予相应药物，除正常对照组外，其余各组于实验第1天和第4天按80 mg/kg的剂量灌胃给予α-萘异硫氰酸酯(ANIT);末次给药后2 h采血，检测血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)等指标，并进行病理组织观察和半定量分析。结果赤芍总苷各剂量组血清学指标及肝组织病变均较模型对照组明显改善(P<0.01)，且具有一定的量效关系。结论赤芍总苷对小鼠胆汁淤积型肝损伤具有保护作用。
       【关键词】  赤芍总苷; 小鼠; 胆汁淤积; 肝损伤; 保护作用
       赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall或川赤芍Paeonia veitchii Lynch干燥根[1]，主要含芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物，总称赤芍总苷，其中芍药苷、芍药内酯苷含量较高[2]。中国人民解放军302医院汪承柏教授为首的专家组经过多年的研究发现，中药赤芍治疗重度黄疸性肝炎效果确切[3]，并被随后的大量研究证实[4，5]，但是迄今为止的研究几乎都停留在单味药或复方层次，未见有相应药效成分的研究报道。为此，本课题组近年来开展了相关研究，结果表明，该药保护胆汁淤积型肝损伤的有效成分主要存在于70%乙醇提取浸膏中[6]，单萜苷类化合物也已基本转移至该部位[7]，采用D101大孔树脂可以纯化其中的赤芍总苷[8]。有研究显示，赤芍总苷对D-氨基半乳糖胺所致的小鼠肝损伤具有保护作用，但是该研究以观察其活血化瘀作用为主要目的[9]。本实验以α-萘异硫氰酸酯(ANIT)诱导的小鼠肝内胆汁淤积型肝损伤模型，对提取纯化的赤芍总苷进行药效观察，以期进一步追踪赤芍治疗黄疸型肝炎的药效物质基础。
       1 材料
       α-萘异硫氰酸酯(ANIT)，购自美国Sigma公司，批号18320LD，临用前植物油溶解;赤芍总苷，自提，方法见文献[7]，其中芍药苷、芍药内酯苷的含量分别为62.01%和2.25%，临用前蒸馏水溶解;赤丹退黄颗粒(长沙九芝堂股份有限公司生产，批号20061206)，临用前蒸馏水溶解。ICR小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(20±2)g，由南通大学动物实验中心提供，动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0021。日立7170全自动生化分析仪(日本日立公司);Axioskop 40型光学显微镜(德国蔡氏公司)。
       2 方法
       2.1 分组与治疗将72只小鼠随机分为正常对照组，模型对照组，赤芍总苷低剂量组(0.32 g/kg)、中剂量组(0.96g/kg)、高剂量组(2.88 g/kg)和赤丹退黄颗粒(3.90 g/kg)阳性药对照组，每组均为12只，雌雄各半;正常对照组和模型对照组灌胃给予生理盐水，其余各组给予相应剂量药物，1次/d，连续6 d。除正常对照组外，其余各组于实验第1天和第4天按80 mg/kg的剂量灌胃给予α-萘异硫氰酸酯(ANIT);实验第6天，所有动物先禁食12 h，于末次给药1 h后断头取血，将血液收集入离心管内，4℃下静置，2 000 r/min离心10 min，取血清，全自动生化分析仪检测各组小鼠血清TBIL、DBIL、ALT、AST、ALP、TBA等指标，同时每组随机取6只动物的左叶肝脏组织，10%甲醛固定，常规HE染色，光镜观察肝组织病理变化，并根据病理分析赋值标准(见表1)进行半定量分析。表1 病理半定量分析赋值标准
       2.2 统计学处理数据以±s表示，组间比较采用stata7.0统计软件包进行单因素方差分析和Scheffe法检验，以P<0.05为显著性判断界值。
       3 结果
       3.1 赤芍总苷对ANIT诱导的急性肝损伤小鼠血清生化指标的影响如表2所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清所有指标均显著升高(P<0.01);赤芍总苷各剂量组均较模型对照组显著下降(P<0.01)，随着剂量的增大几乎所有指标均呈下降趋势，但无统计学意义(P>0.05);与阳性药赤丹退黄颗粒对照组比较，赤芍总苷各剂量组AST明显下降(P<0.01或P<0.05)，其余指标均无显著差异(P>0.05)。
       3.2 肝脏病理组织学观察光镜下可见，正常对照组肝小叶结构正常，肝细胞排列呈索状，无坏死及变性，肝窦无扩张，毛细胆管无淤胆，汇管区未见炎性细胞浸润，胆管结构正常;模型对照组肝小叶可见较多坏死灶，肝细胞明显肿胀，变性，细胞排列紊乱，肝窦有扩张，毛细胆管淤胆明显，汇管区有大量炎症细胞浸润，胆管上皮细胞水肿，空泡变性多见，易见固缩坏死，胆管上皮明显增生;赤芍总苷小剂量组肝小叶结构存在，肝细胞可见肿胀，变性，局部有坏死灶存在，汇管区见炎细胞浸润，胆管上皮有空泡变性，同时可见结缔组织增生;赤芍总苷中剂量组肝小叶结构存在，细胞排列整齐，肝细胞可见肿胀，无明显坏死灶，细胞变性及毛细胆管淤胆不明显，汇管区炎性细胞浸润明显减轻，胆管上皮增生不明显，病变程度明显轻于低剂量组;赤芍总苷大剂量组肝小叶无明显坏死灶，部分肝细胞可见混浊肿胀，无明显细胞变性及毛细胆管淤胆，汇管区有少量炎细胞浸润，血管扩张瘀血及胆管上皮增生不明显;赤丹退黄颗粒组病变情况与赤芍总苷中剂量组相近。表2 赤芍总苷对急性肝损伤小鼠血清生化指标的影响半定量分析结果显示(见表3)，模型组较正常对照组的肝组织结构有显著变化(P<0.01)，与模型组比较，赤芍总苷各剂量组及赤丹退黄颗粒组肝组织病变程度均有明显好转(P<0.01);中剂量组及大剂量组病变程度明显轻于低剂量组(P<0.01);中剂量组与阳性对照组比较无显著差异(P>0.05)，而大剂量组的护肝作用明显优于赤丹退黄颗粒组(P<0.01)。从本实验结果看，赤芍总苷各剂量组间有量效关系。表3 病理半定量分析结果
       4 讨论
       ANIT作为一种肝毒剂，主要损害肝内胆管上皮细胞，引起肝内胆管增生及小叶间胆管周围炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁瘀积，并伴有以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生胆汁淤积性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌降低。ANIT被广泛应用于肝内胆汁淤积模型的复制，该模型复制简单易行，重现性好，是筛选和研究保肝药物及利胆药的理想实验动物模型[10]。
       正常情况下，胆红素组成胆汁，排入胆道，当肝细胞发生病变、肝细胞肿胀、肝小管管腔闭塞，排泄胆汁受阻，则血中胆红素升高，就发生了胆汁淤滞性和肝细胞性黄疸;ALT与AST主要分布在肝细胞内，当肝细胞受损时，细胞膜通透性增加而渗漏出来，其指标在血液中升高的程度与肝细胞受损程度相一致;ALP几乎存在于机体的各个组织，正常情况下血清中的ALP经血液流到肝脏，从胆道系统排泄，淤胆型肝炎时此酶明显升高。TBIL、ALP、ALT、TBA是胆汁淤积的4项常规指标[11]，我们以这4项指标为主，结合DBIL、AST，作为判断胆汁淤积程度的指标，同时也作为衡量供试药物疗效的指标。
       本实验采用ANIT复制小鼠肝内胆汁淤积模型，模型组血清学指标及肝脏病理半定量分析结果均较正常组明显升高(P<0.01)，表明造模成功;赤芍总苷各剂量组各项指标均较模型组明显改善(P<0.01)，且呈现了一定量效关系;与赤丹退黄颗粒对照组比较，赤芍总苷中、高剂量组AST及高剂量组病理赋值显著下降(P<0.01)。以上结果提示，赤芍总苷对ANIT诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用，药效与赤丹退黄颗粒相当或稍优，可能是赤芍治疗黄疸型肝炎的主要药效物质之一
       【参考文献】
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