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       【摘要】 
       目的探讨蒿鳖养阴软坚方减轻酒精性肝损伤的作用。方法采用酒精灌胃及高脂饲料、吡唑和羰基铁等建立大鼠酒精性肝病模型，灌胃蒿鳖养阴软坚方预防性治疗。造模10周后检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST) 、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、丙二醛(MDA)、肝组织胶原蛋白含量和基质金属蛋白酶-2,-9(matrix metalloproteinases 2,9;MMP-2,MMP-9)，光镜观察肝组织病理变化。结果与模型对照组比较，蒿鳖养阴软坚方高、低剂量组死亡率、ALT、AST、GLOB、MDA、胶原蛋白、MMP-2及MMP-9的水平显著降低(P<0.05)，白蛋白含量显著升高(P<0.05)。同时模型对照组大鼠肝组织出现点、灶状坏死、大量脂滴、炎细胞浸润，蒿鳖养阴软坚方组见少数肝细胞肿胀、脂滴少、炎症细胞浸润轻。结论蒿鳖养阴软坚方能减轻酒精性肝损伤，其部分作用机制包括抗脂质过氧化损伤、降低MMP-2和MMP-9的水平/活性。
       【关键词】  蒿鳖养阴软坚方; 酒精性肝病; 基质金属蛋白酶-2,-9; 脂质过氧化物; 胶原蛋白
       酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)已成为一种世界性的疾病，表现为肝脏发生不同程度的脂肪变性、炎症和坏死，继而形成肝纤维化和肝硬化甚至肝癌。目前，对ALD尚无特效治疗方法，以戒酒和营养支持为主;治疗药物主要有水飞蓟素、复方甘草酸苷、糖皮质激素、维生素类、还原型谷胱甘肽、多烯磷脂酰胆碱、腺苷蛋氨酸、硫普罗宁等, 其确切疗效报道不一[1]，某些药物甚至可损害肝脏。近年来，中医中药辨证治疗本病在改善临床症状、提高临床疗效等方面已显示出一定优势。随着酒精性肝病的进展，其治疗越来越困难，故防治酒精性肝病已成为研究的热点。本研究探讨蒿鳖养阴软坚方对大鼠酒精性肝损伤的预防作用并初步分析其作用机理，为其防治酒精性肝病提供实验依据。
       1 材料
       1.1 动物SPF级 Wistar大鼠100只，雄性，体质量200～240 g，购自军事医学科学院实验动物中心。
       1.2 药物蒿鳖养阴软坚方经药学及药理研究确立生产工艺后按中试规模制备为原料药粉，以复方药物成分青蒿素(HPLC-ELSD测定)、丹酚酸B和虎杖苷(HPLC测定)作为质控指标，实验前溶于双蒸水配成一定浓度的溶液。秋水仙碱为Sigma公司产品。
       1.3 造模原料吡唑为Fluca公司产品，羰基铁粉(YTF-0，基础粉)由岳龙超细金属材料有限公司提供，衡水老白干(酒精体积分数为65%)由衡水安平人和酒业生产。大鼠基础饲料(面料)由中国医学科学院实验动物研究所繁育场提供，金龙鱼玉米油为嘉里粮油(天津)有限公司产品，猪油购自市场。自制高脂饲料含大鼠基础饲料80%、猪油4%、玉米油16%和羰基铁0.125%，均为质量分数。
       1.4 试剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)和总蛋白(TP)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所提供。
       2 方法
       2.1 造模造模大鼠8:00灌胃白酒，1次/d，酒精浓度逐渐增加，依次为10%，20%，30%，40%，50%，60%，每个浓度灌胃2 d，最后增至65%并维持该浓度再灌胃8周，该维持剂量相当于6.2 g·kg-1·d-1，体积均为1.2 ml·(100g)-1·d-1，并用吡唑25 mg·kg-1·d-1 溶于酒内灌胃。期间，造模大鼠饮用10%酒，食用高脂饲料。正常对照大鼠每日同时灌胃蒸馏水，以自来水和大鼠标准饲料喂养。
       2.2 分组用药实验分2批进行，每批随机取4只大鼠为正常对照组(正常组，共8只)，其余均用于造模。当灌酒浓度增加到65%时，对造模大鼠按体重随机区组法分组为模型对照组(模型组，32只)、蒿鳖养阴软坚方高、低剂量组(各20只)、阳性对照药秋水仙碱组(20只)。同时进行预防性用药，每天一次于傍晚灌胃治疗药物，分别以蒿鳖养阴软坚方和秋水仙碱的临床等效剂量，按公式dB = dA ×(RB /RA ) ×(WA/WB)13 计算出大鼠用药剂量，由此算得的蒿鳖养阴软坚方用量作为低剂量(2.59 g·kg-1·d-1)，以该剂量的1012 倍作为高剂量(8.2 g·kg-1·d-1);秋水仙碱组剂量为0.09 mg·kg-1·d-1。模型组傍晚灌胃蒸馏水。
       2.3 标本留取与指标观测大鼠一般情况;10 周后结束实验，乙醚麻醉大鼠，腹腔静脉取血，留取肝脏组织。①肝组织脱脂脱水用于测定羟脯氨酸含量[2]，再换算为胶原蛋白含量。②MMP-2、MMP-9检测用明胶酶谱法[3]：取-80℃冻存的肝组织50 mg，以PBS冰浴匀浆，12 000 r/min 30 min离心抽提蛋白;用考马斯亮蓝G-250法进行蛋白定量;配制SDS-PAGE胶(已加入底物明胶)，以每孔50 μg蛋白量上样，进行电泳;电泳结束后，凝胶经洗脱、孵育、考马斯亮蓝染色、脱色至显示出MMP-2和MMP-9为位于蓝色背景上的透亮条带;经标准蛋白对照，为酶原型MMP;以凝胶成像仪扫描，用分析软件测定酶分解条带的亮度和面积。③肝组织用10%中性缓冲甲醛液固定，石蜡包埋，常规切片，HE染色，光镜观察肝脏病理改变。病理分级标准参照文献[4]：1 级：脂肪变<30%，局灶性气球样变，少数小坏死灶;2 级：脂肪变>30%，气球样变，多数小坏死灶，Mallory 小体形成，局部中性粒细胞浸润;3 级：脂肪变>50%，坏死灶融合或形成桥接坏死，伴明显的Mallory小体形成;4 级：脂肪变>75%，损伤广泛。④血清脂质过氧化物(MDA)用荧光分光光度法检测[5];血清ALT、AST、ALB、TP按试剂盒的方法测定，球蛋白(GLOB)=TP-ALB。
       2.4 统计分析SPSS11.5 软件。计量资料用±s表示，采用单因素方差分析;等级资料多组间比较用Kruskal-Wallis H检验，两组间比较用Mann-Whitney U检验;计数资料用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
       3 结果
       3.1 大鼠死亡率及体质量实验过程中，正常组8只大鼠全部存活;模型组死亡23只存活9只，死亡率(71.9%)较正常组显著升高(P<0.01);蒿鳖养阴软坚方高剂量组死亡10只存活10只(死亡率50%)，蒿鳖养阴软坚方低剂量组死亡9只存活11只(死亡率45%)，秋水仙碱组死亡12只存活8只(死亡率60%)，各治疗组死亡率较模型组显著降低(P<0.05)。模型组大鼠体质量低于正常组和各治疗组。
       3.2 大鼠肝组织病理改变正常组大鼠肝小叶结构、中央静脉和汇管区结构正常，肝细胞无变性及坏死，未见炎症细胞浸润(图1，图2);模型组中央静脉周围肝细胞肿胀，胞浆疏松化，肝细胞溶解坏死，胞浆内出现大量脂滴，呈中至重度脂肪变，伴大量炎症细胞浸润(图3，图4);蒿鳖养阴软坚方组见少数肝细胞肿胀, 胞浆疏松化，个别胞浆中出现脂滴，少数炎症细胞浸润(图5～6)。各组病理结果见表1。表1 酒精性肝病大鼠肝脏病理改变图1 正常组大鼠肝组织 图2 正常组大鼠肝组织　　(HE ，100×) (HE，200×)图3 模型组大鼠肝组织 图4 模型组大鼠肝组织(HE ，100×) (HE，200×)
       3.3 大鼠肝组织胶原蛋白含量和血清MDA含量模型组大鼠肝组织胶原蛋白和血清MDA含量较正常组显著升高(P<0.01);治疗组肝组织胶原蛋白和血清MDA含量较模型组显著降低(P<0.01);各个治疗组之间胶原蛋白和血清MDA含量无显著差异。见表2。
       3.4 大鼠血清ALT、AST、ALB、GLOB含量模型组大鼠血清ALT、AST和GLOB含量较正常组显著升高(P<0.01)，治疗组血清ALT、AST和GLOB含量较模型组显著降低(P<0.01);模型组大鼠血清ALB含量较正常组显著降低(P<0.01)，治疗组血清ALB含量较模型组显著升高(P<0.01);各个治疗组之间ALT、AST、ALB、GLOB含量无显著差异。见表3。
       3.5 大鼠肝组织MMP-2、MMP-9水平电泳胶上显示的透亮条带是酶原型MMP-2和MMP-9活化之后对明胶的水解条带(图7)。模型组大鼠肝组织MMP-2和MMP-9水解条带的亮度和面积较正常组显著升高(P<0.01);治疗组肝组织MMP-2和MMP-9水解条带的亮度和面积较模型组显著降低(P<0.01);各个治疗组之间的差异无显著意义。见表4。图5 蒿鳖养阴软坚方组大鼠 图6 蒿鳖养阴软坚方组肝组织(HE ，100×) 大鼠肝组织(HE，200×)表2 酒精性肝病大鼠肝组织胶原蛋白和MDA含量变化　　表3 酒精性肝病大鼠血清ALT、AST、ALB和GLOB含量变化图7 MMP-2, MMP-9明胶酶谱图表4 酒精性肝病大鼠肝组织MMP-9、MMP-2变化
       4 讨论
       4.1 关于酒精性肝病模型对动物如大鼠灌胃乙醇，可引起酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化等。有三大类造模方法：采用含全营养素和酒精的液体饲料;给大鼠植入胃管持续注入含酒精的液体饲料;灌胃酒精等。通常加用4类因素：高脂饲料;乙醇脱氢酶抑制剂吡唑;加重脂质过氧化损伤的铁剂;尾静脉注入内毒素。特别是同时加用吡唑及高脂饲料[6]或再加用羰基铁。本研究的系列工作表明：如用上述复合因素，同时酒精用量为8～12 g·kg-1·d-1，则羰基铁和玉米油不宜作混悬液灌胃，否则羰基铁由于其重量而沉于胃底而使胃下沉，且使胃充盈及幽门痉挛水肿等使胃内容物不能排出，以及由此引起的营养物质吸收障碍，以致第1、2、3批预试验结果分别为：20只大鼠10 d内全部死亡;10只除1只大鼠存活40 d外其余均于半月内死亡;10只大鼠半月内全部死亡。故本研究正式实验将造模方法改为：将玉米油、猪油及羰基铁加至基础饲料面料中制作饼块，将吡唑溶于酒精中灌胃，后来仍因模型对照组死亡率高达71.9%，以至灌胃酒精6.2 g·kg-1·d-1仅8周即被迫终止实验。表现为：模型组肝细胞出现显著的脂肪变性，肝细胞呈点状、灶状坏死，肝内炎细胞浸润;同时肝功能受损，表现为ALT、AST及球蛋白明显升高，白蛋白明显降低;并且肝组织羟脯氨酸含量显著增高，这在中途死亡的大鼠更明显，部分大鼠中央静脉周围和血窦部位可见纤维组织增生，这表明大鼠已形成酒精性脂肪肝、肝炎和肝纤维化，如果能延长造模时间，肝纤维化程度将更重。
       4.2 蒿鳖养阴软坚方具有减轻酒精性肝损伤的作用蒿鳖养阴软坚方由青蒿、鳖甲、生地、丹参、虎杖等组成，这些药物多有保肝作用，系列研究表明该方对CCl4、牛血清白蛋白和血吸虫尾蚴感染等所致的实验性肝纤维化有确切的预防和治疗作用，该方在临床上对慢性肝病有良好的疗效。本研究从肝组织形态及羟脯氨酸含量与肝功能方面证明蒿鳖养阴软坚方对大鼠酒精性脂肪肝、肝炎和肝纤维化有显著的预防作用。
       4.3 蒿鳖养阴软坚方预防酒精性肝病的作用机制
       4.3.1 抗脂质过氧化损伤本研究表明酒精性肝病大鼠脂质过氧化物水平增高。现认为乙醇及其代谢产物对肝脏的损伤以及通过影响免疫因素、氧化应激和脂质过氧化等在酒精性肝病过程中发挥着重要作用[7]，脂质过氧化物增多是酒精性肝纤维化的一个关键病理事件[8]，乙醇诱导CYP2E1、CYP2A6和CYP3A4产生多种反应性氧类，损伤细胞膜系结构，产生脂质过氧化物4-羟基-壬烯醛和丙二醛(MDA)，同时乙醇损伤抗氧化防御系统[9]。因此MDA可反映脂质过氧化损伤的净效应。蒿鳖养阴软坚方高、低剂量组的MDA水平明显低于模型对照组，表明该方具有抗脂质过氧化损伤的作用，可能为其预防酒精性肝炎和肝纤维化的作用机制之一，虽然其具体作用环节仍有待探讨。
       4.3.2 降低MMP-2和MMP-9的水平/活性基质金属蛋白酶(MMPs)降解肝内细胞外基质(ECM)，有两种作用：一方面MMP-1降解胶原可消除/减少肝脏中沉积的胶原纤维或防止其沉积;另一方面， MMP-2、MMP-9可降解正常肝血窦基底膜(由IV型胶原等构成)，导致肝血窦毛细血管化和胶原化，破坏了细
       胞与细胞、细胞与基质间的正常关系，引起或加剧肝纤维化。在肝脏，肝星状细胞(HSC)是MMP-2的主要来源，当其转化为肌成纤维细胞后可产生大量MMP-2，库普弗细胞(KC)是MMP-9的主要来源，炎性损伤等可活化HSC及刺激KC，使MMP-2、MMP-9产生增多。本研究经酶谱法证实酒精性肝病造模10周大鼠肝脏MMP-2和MMP-9水平/活性显著升高，报道采用免疫组化法观察到酒精性肝病造模4，8，12，16周肝脏MMP-2和MMP-9进行性增加[10]。高、低剂量的蒿鳖养阴软坚方能降低MMP-2、MMP-9水平/活性，此可能通过其抗炎作用或直接抑制HSC等，系列研究表明该方药物血清能阻抑HSC细胞周期而抑制其增殖，从而减轻肝损伤、防止肝纤维化，故降低MMP-2和MMP-9的水平/活性可能是该方防治肝损伤的另一作用机制。
       【参考文献】
         　[1] 刘 琴,程明亮.酒精性肝病的药物治疗和评价[J].药品评价,2007,4(4):289.
       
       [2] Jamall IS, FinelliVN, Que Hee SS. A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues [J]. Analytical Biochemistry, 1981, 112(1):70.
       
       [3] 王俊丽,徐文方.基质金属蛋白酶及其抑制剂的活性测定方法[J].中国新药杂志,2003, 12(7):504.
       
       [4] 王泰龄.酒精性肝病的病理和分类[J].胃肠病学,2003,8(5):299.
       
       [5] Yagi K. A simple fluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma[J]. Biochem Med, 1976, 15(2):212.
       
       [6] 杨 华,张丽军,冯艳玲,等.酒精复合性肝纤维化大鼠模型的建立及动态观察[J].实验动物与比较医学,2008,28(4):234.
       
       [7] Arteel GE. Oxidants and antioxidants in alcoho1 induced liver disease [J]. Gastroenterology, 2003, 124(3):778.
       
       [8] 赵 菁,李 燕.酒精性肝纤维化中肝星状细胞活化的机制研究进展[J].国外医学药学分册, 2006,33(3):198.
       
       [9] Seitz HK, Stickel F. Risk factors and mechanisms of hepatocarcinogenesis with special emphasis on alcohol and oxidative stress [J]. Biol Chem, 2006, 387(4):349.
       
       [10] 吕晓辉,王炳元,谢艳华,等. 基质金属蛋白酶-2和-9在实验性酒精性肝病中的动态变化及表达[J].中华肝脏病杂志,2001,9(5):268.