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       【摘要】 
       目的研究新疆紫草的止血作用。方法分别给小鼠连续灌胃给予新疆紫草正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇和水提取物7 d，采用断尾法考察对小鼠出血时间的影响，确定有效部位。在此基础上，用新疆紫草醋酸乙酯提取物分别给小鼠和大鼠连续灌胃给药14 d， 测定小鼠凝血时间(CT) 、出血时间(BT)和血小板计数，大鼠活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT) 、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)含量的改变。结果新疆紫草醋酸乙酯提取物能显著缩短CT、 BT、升高血小板数量、缩短凝血酶时间(TT)、提高纤维蛋白原含量(FIB)。结论新疆紫草醋酸乙酯提取物具有较好的止血作用，其机理可能与增加纤维蛋白原含量，促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程，升高小鼠血小板数量，影响抗凝和纤溶系统有关。
       【关键词】  新疆紫草; 止血作用; 凝血时间 ; 凝血酶时间; 纤维蛋白原; 血小板
       中药紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma Johnst.，紫草Lithospermun erythrorhizon Sieb.et Zucc.或内蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。具有凉血、活血、解毒透疹等功效[1]。在中医和维吾尔医均用于治疗许多难治性疾病如肿瘤、艾滋病、过敏性紫癜、银屑病等。紫草含有多种生物活性成分。现代药理学研究发现这些成分具有抗肿瘤、抗菌消炎、保肝、抗病毒及真菌、抗生育、降血糖、抗免疫缺陷、抗凝血、止血、抗前列腺素生物合成及抗脂质过氧化等作用[2]。杨荣等[3]研究了软紫草Arnebia euchroma Johnst.，黄花软紫草A.guttata Bge.，紫草Lithospermun erythrorhizon Sieb.et Zucc.)，滇紫草Onosma paniculatum Bur.et Franch.，露蕊滇紫草O.excertum Hemsl.和密花滇紫草O.Confertum w.w.Simth.水提物和醇提物对小鼠断尾出血的作用，发现这6种紫草的水提液和醇提液均有不同程度的止血作用。其中软紫草的水提液和黄花软紫草的醇提液作用较好。新疆紫草在新疆分布广泛，品质最佳。在以往的研究中，课题组研究了新疆紫草的提取物的保肝作用[4～7]。为进一步深入研究新疆紫草的止血作用和有效部位，我们初步考察了新疆紫草的正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇和水提取物对小鼠出血时间的影响，发现这些提取物均可缩短断尾小鼠出血时间，其中醋酸乙酯提取物的作用优于其它提取物。因此，本文报道了新疆紫草醋酸乙酯提取物对小鼠出血时间(BT)、凝血时间(CT)、小板计数以及大鼠血液凝集参数的影响，为进一步开发利用新疆紫草奠定基础。
       1 材料与仪器
       1.1 药材与试剂新疆紫草(新疆参茸药业有限责任公司，批号07112701，由新疆医科大学药学院生药学教研室进行品种鉴定);云南白药(云南白药集团股份有限公司， 批号 20081208);戊巴比妥钠(化学纯，北京通县育才精细化工厂，批号950427);正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇等均为分析纯，醋酸泼尼松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号 080977)。水为纯净水。APTT、 TT、PT、FIB试剂盒 Dianstatica Stago。
       1.2 动物昆明种小鼠,体质量18～22 g , Wistar大鼠，体质量180～220 g，雌雄各半，由新疆医科大学实验动物中心提供(许可证号SYXK-新2003-0001)。自由摄食进水，饲料由实验动物中心提供，室温18～25℃饲养。
       1.3 仪器 SYSMEX CA-7000全自动血凝仪(日本);DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);BS224s 电子分析天平( Sartorins公司);旋转蒸发器RE-52(上海亚荣生化仪器厂); SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵(郑州长城科教仪器有限公司)，内径1 mm 的毛细玻璃管、灌胃管、注射器、血细胞计数板、显微镜。手术刀，眼科弯镊，秒表，载玻片，滤纸等。
       2 方法
       2.1 供试品的制备称取紫草粉末(过40目筛)500g，分别用正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇、水，于70，77，80，95～100℃下回流提取3次(2，2，1 h)，料液比为1∶5，合并回流液，过滤，经减压回收溶剂浓缩成浸膏，分别得提取物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，备用。临用前用0.5 % 羧甲基纤维素钠配制成所需浓度的混悬液备用，药物量以按原药材计算。
       2.2 止血有效部位的筛选 采用断尾法考察以上4个提取物对小鼠出血时间的影响。取小鼠50 只，随机分为空白(0.5%CMC-Na)对照组;给药组：高剂量(20 g· kg-1) 、中剂量(10 g· kg-1) 和低剂量(5 g· kg-1);阳性对照组：云南白药(0.8 g· kg-1)，每组10 只。各组每日分别灌胃给药Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ1次,连续7 d。末次给药后60 min ,将小鼠固定,露鼠尾于外,用手术刀片于小鼠尾尖1/ 2 处横断(严格控制切割深度),待血液自行溢出开始计时每隔30s用滤纸吸去血滴1次,直至血流自然停止(滤纸吸时无血) 为止,即为出血时间。记录小鼠出血时间(BT)。计算出血时间的缩短率。结果以SPSS12.0 统计软件，进行t检验。见表1～4。BT缩短率(%)=空白对照组BT-给药组BT空白对照组BT×100%表1 新疆紫草正己烷提取物的止血时间表2 新疆紫草醋酸乙酯提取物的止血时间表3 新疆紫草乙醇提取物的止血时间表4 新疆紫草水提取物的止血时间由表1～4中数据可看出，与空白对照组相比，所有提取物均可不同程度缩短小鼠的止血时间，其中醋酸乙酯提取物出血时间的差异有统计学意义(P<0.05)。据此，确定醋酸乙酯部位为止血有效部位。
       2.3 醋酸乙酯提取物对出凝血相关指标的影响
       2.3.1 对小鼠凝血时间的影响[8]
       毛细管法：取小鼠50 只,随机分为空白(0.5%CMC-Na)对照组,给药组：高剂量(20 g· kg-1) 、中剂量(10 g· kg-1) 和低剂量(5 g· kg-1);阳性对照组：云南白药(0.8 g· kg-1)，每组10 只。各组每日灌胃给药1次,连续14 d。末次给药后60 min ,参照毛细管法,用内径为1 mm 的毛细玻管插入小鼠内眦球后静脉丛,深约4～5 mm ,轻轻转动再缩回,自血液流入玻管内开始计时,达5 cm 血柱后取出毛细管平放于桌上。每隔30 s 折断毛细管0.5 cm ,观察折断处有无血凝丝出现,记录从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间,此即为凝血时间。玻片法：分组及给药方法同上，末次给药后60 min，用眼科镊迅速摘去一侧眼球,于载玻片两端各滴1滴血,血滴直径约6mm ,立即用秒表计时,每隔30 s 用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻挑动1 次,并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止,所历时间即为凝血时间,另一滴血供复验。
       2.3.2 对小鼠出血时间的影响取小鼠50 只，分组、给药及操作方法上。末次给药后60 min ,将小鼠固定,露鼠尾于外,用手术刀片于小鼠尾尖1/ 2 处横断(严格控制切割深度),待血液自行溢出开始计时每隔30s用滤纸吸去血滴一次,直至血流自然停止(滤纸吸时无血) 为止,即为出血时间。记录小鼠出血时间(BT)。
       2.3.3 对小鼠血小板计数的影响取小鼠50只, 随机分为空白(CMC-Na)对照组, 给药组：高，中，低剂量组;阳性对照组(醋酸波尼松片按0.011g· kg-1剂量),每组10 只。给药方法同上, 末次给药后60min ,摘除小鼠右侧眼球取血,用微吸管吸血20μl于1 %草酸铵溶液0.38 ml内,充分摇匀,吸一小滴置于血细胞计数板, 静止10～15min 后,于高倍光学显微镜下计数各鼠血小板数量。
       2.3.4 对大鼠血液凝集参数的影响 取Wistar大鼠50只，随机分成5组。分别为空白对照组;给药组：高剂量(14g·kg-1)、中剂量(7·kg-1g)和低剂量(3.5g·kg-1);阳性对照组(云南白药：0.9g·kg-1)，每组10只，灌胃给药1次/d，灌胃体积2ml/只，连续给药14天。实验第14天，每组大鼠相隔40 min给药，给药后1 h依次腹腔注射3%戊巴比妥钠生理盐水溶液0.6 ml麻醉，固定，迅速剥离腹主动脉，一次性注射器采血，立即注入于一次性真空采血管(含0.3ml，0.109 mol/L的枸椽酸钠抗凝剂)中，轻轻颠倒摇匀后，立即于3 000 r/min离心10 min。取血清400μl，用凝固法按试剂盒说明测定PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)、TT(凝血酶时间)、FIB(纤维蛋白原含量)。
       3 结果
       3.1 对小鼠凝血时间的影响与空白对照组相比，无论是玻片法还是毛细管法，各剂量组凝血时间明显缩短。高、中、低剂量给药组的凝血时间差异显著(P < 0.01或P < 0.05)。与阳性对照组相比，各剂量组凝血时间与云南白药相似。说明新疆紫草醋酸乙酯提取物具有促凝血作用。结果见表5。
       3.2 对小鼠出血时间的影响与空白对照组相比，各剂量组出血时间明显缩短。高、中、低剂量给药组的出血时间差异均显著(P< 0.01或P< 0.05)。其出血时间随给药剂量的减小而缩短。与阳性对照组相比，高剂量组出血时间与云南白药接近。说明新疆紫草醋酸乙酯提取物能够明显缩短小鼠出血时间。结果见表5。
       3.3 对小鼠血小板计数的影响 与空白对照组相比，各剂量组的血小板数量不同程度的升高。低剂量给药组的血小板数量升高明显(P< 0.01)。高、中剂量组血小板数量的变化无统计学意义(P﹥ 0.05)，与阳性对照药醋酸波尼松接近。说明新疆醋酸乙酯提取物在低剂量时，能够明显升高小鼠血小板数量。结果见表5。
       3.4 对大鼠血液凝集参数的影响与空白对照组相比，各剂量组的PT、APTT的变化无统计学意义(P>0.05);TT明显缩短(P<0.05)，与阳性对照组相似;FIB的含量显著提高(P<0.05)，略高于阳性对照组。阳性组FIB的含量与空白对照组的差异，无统计学意义(P>0.05)。结果见表6。
       4 讨论
       我们分别考察了新疆紫草正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇和水提取物连续灌胃给药7 d时对小鼠出血时间的影响，以确定其有效部位。结果，以上提取物均可不同程度缩短小鼠的出血时间。正己烷提取物3个剂量出血时间缩短率分别为22.36%、10.87%和25.51%，醋酸乙酯提取物分别为9.89%、31.28%和39.91%，95%乙醇提取物分别为32.38%、17.37%和34.40%，而水提物分别为45.70%、42.97%和43.71%。从这些数值的大小看，水提物的出血时间缩短率大于其他各组，但醋酸乙酯提取物的出血时间缩短率具有明显的剂量相关性，统计分析结果也显示，与空白对照组比较，醋酸乙酯提取物缩短小鼠的出血时间的差异具有统计学意义(P <0.05)。据以往的文献报道，软紫草的水提物止血效果优于醇提物，该文献未提及其他溶剂提取物的止血作用。综合以上结果，我们以醋酸乙酯提取物为样品，考察了对小鼠凝血时间(CT)、出血时间(BT)、血小板计数以及大鼠血液凝集参数的影响。结果显示，新疆紫草醋酸乙酯提取物能显著缩短小鼠CT、BT，升高小鼠血小板数量、缩短凝血酶时间(TT)、提高纤维蛋白原含量(FIB)。对凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)无影响。表5 新疆紫草对小鼠凝血时间的影响表6 对大鼠血液凝集参数的影响血液凝固是一系列酶促过程，最后使纤维蛋白原变为纤维蛋白，血液由溶胶状态转为凝胶状态，凝血酶在止、凝血中也发挥了重要的作用。PT值反映外源性凝血因子，APTT值反映内源性凝血因子，而TT值则是主要反映凝血共同途径纤维蛋白原转变为纤维蛋白过程中的重要指标。血小板在血液凝固过程中发挥着重要作用，它的黏附、聚集、释放起到止血作用，同时它还为各种凝血酶原的活化提供必需的膜磷脂。因此可以推测紫草醋酸乙酯提取物的止血作用可能是通过增加纤维蛋白原含量，促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程。升高小鼠血小板数量，影响抗凝和纤溶系统起作用,而对外源和内源性凝血因子无影响。
       新疆紫草的化学复杂，主要有萘醌类色素，酚酸类、生物碱类、苯酚及苯醌类、三萜及甾醇类、黄酮类以及多糖类等物质。这些化合物的极性和在不同溶剂中的溶解性不同，反映在不同溶剂提取物的药效不同。实验中观察到，新疆紫草正己烷、醋酸乙酯、95%乙醇和水提物均显示有一定的止血作用，说明新疆紫草的止血有效成分中既有极性小的化合物，又有极性大的水溶性化合物。同时观察到，醋酸乙酯提取物在低剂量时，对BT、血小板计数、TT、FIB的影响大于中、高剂量组。原因可能在提取物中存在有极性相似的多种化合物，在中、高剂量组这些化合物中的非有效成分含量相对较高，干扰或掩盖了止血有效成分的作用，而在低剂量时，止血有效成分作用凸显的结果。新疆紫草不同极性部位中止血有效成分及作用机理有待于进一步研究。
       【参考文献】
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