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       【摘要】 
       目的研究补肾明目口服液对慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴细胞(PBL)凋亡和Fas、FasL表达活性的影响， 探讨补肾明目口服液在葡萄膜炎慢性化发病机制中的干预作用。方法采用血清药理学方法，制取补肾明目口服液含药兔血清。运用流式细胞仪检测8例慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴细胞在不同浓度的补肾明目口服液的含药血清(20%，10%，5%)刺激下淋巴细胞凋亡和自杀相关因子/自杀相关因子配体(Fas/FasL)表达的变化。结果慢性葡萄膜炎患者PBL凋亡率低于正常组(P<0.05)，Fas表达高于正常组(P<0.05)，FasL表达与正常组差异不明显(P>0.05); 10%，20%含药血清可增加慢性葡萄膜炎患者PBL的凋亡率(P<0.01)，降低Fas表达(P<0.01)，升高FasL的阳性细胞率(P<0.01)。结论慢性葡萄膜炎患者PBL存在凋亡及凋亡相关蛋白表达的紊乱，中药补肾明目口服液在体外可纠正其紊乱，增高PBL的凋亡。研究为中药延缓慢性葡萄膜炎复发提供了理论基础。
       【关键词】  慢性葡萄膜炎; 补肾明目口服液; 细胞凋亡; 自杀相关因子/自杀相关因子配体
       葡萄膜炎是一类常见的难治性复发性眼病。其发病机制复杂，但除感染性葡萄膜炎外，其余绝大多数是由自身免疫应答所致。研究发现[1～3]患者淋巴细胞对凋亡有很大抵抗性，造成了自身免疫性淋巴细胞长期存在，导致了葡萄膜炎的慢性化或复发。T淋巴细胞凋亡相关基因蛋白自杀相关因子/自杀相关因子配体(Fas/FasL)系统介导的凋亡参与免疫反应过程中淋巴细胞的调控。本实验选用我院长期临床使用的补肾明目口服液，探讨其对葡萄膜炎慢性化发病机制的干预作用。
       1 材料与方法
       1.1 试剂及设备RPMI1640培养液(invitrogen公司)，胎牛血清(武汉三利)，FITC-CD95单克隆抗体及PE-CD178单克隆抗体 ( 美国biolenged公司)，AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒(碧云天),人淋巴细胞分离液(天津TBD)， 流式细胞仪( 美国BD公司)。
       1.2 动物含药血清的制备选用成年家兔8只，雌雄各半，分为两组，每组4只，一组补肾明目口服液(中成药)灌胃，另一组生理盐水灌胃，2次/d(间隔6 h)，连续7 d，末次灌胃后1 h，严格无菌心脏采血，-4℃静置过夜，取出后，1 500 r/min离心，10 min，抽取血清。制成含药血清原液和盐水血清，56℃、30 min灭活，-20℃冰箱保存。使用前将含药血清原液与RPMI1640培养基按1∶1，1∶3体积混合，分别制成50%，25%的含药血清。
       1.3 慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes ，PBL)的分离及培养符合慢性葡萄膜炎诊断标准[4]及中医肾虚肝热辨证标准[5]患者8例，健康者5例，清晨抽取受检者空腹静脉血8 ml，枸橼酸钠抗凝，人淋巴细胞分离液分离单一核细胞。加入含有10%小牛血清的RPMI1640，培养细胞。见图1～2。
       1.4 慢性葡萄膜炎患者PBL在植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激培养下凋亡及Fas，FasL表达的检测取9 mlPBL细胞悬液，加入植物血凝素1 ml(PHA终质量浓度为20 μg/ml)刺激细胞。取160 μl含PHA的PBL细胞悬液，加入96孔培养板，每孔再加入RPMI 1 640培养液40 μl，37℃，5%CO2孵育72 h后，分别用于凋亡及Fas,FasL表达的检测。在进行完细胞凋亡刺激后，取5万～10万重悬的细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入195微升 Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞，进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。各取100 μl细胞，水平离心后弃上清液， 分别加入FITC标记的Fas单抗，PE标记的FasL单抗各20 μl，室温避光30 min后，加入500 μl PBS，1 h内行流式细胞仪检测。Fas，FasL的结果均以阳性细胞百分数表示。图1 分离后的淋巴细胞图2 培养72h后的淋巴细胞
       1.5 含补肾明目口服液血清对慢性葡萄膜炎患者PBL凋亡及Fas,FasL表达的检测取160 μl含PHA的PBL细胞悬液，每孔分别加入RPMI 1640培养液40 μl，盐水血清40 μl，25%，50%含药血清及含药血清原液各40 μl(含药血清终浓度分别为5%，10%，20%);37℃，5%CO2孵育72 h后行PBL凋亡率及Fas，FasL表达的检测，方法同上。
       1.6 统计学方法细胞凋亡、Fas，FasL表达用阳性细胞百分数表示。采用两独立样本比较的T检验。方差分析，组间两两比较采用最小显著差异检验法(LSD)检验，α=0.5。均使用SPSS13.0软件进行数据分析。
       2 结果
       2.1 慢性葡萄膜炎患者外周血淋巴细胞在PHA刺激培养后凋亡率、Fas和Fasl表达情况 见表1及图3。表1 患者外周血淋巴细胞凋亡率、Fas和FasL表达情况　图3 流式细胞图
       2.2 不同药物浓度补肾明目含药血清对慢性葡萄膜炎患者PBL凋亡率、Fas和Fasl表达的影响见表2。表2 不同药物浓度时患者PBL调亡率、Fal及FasL表达的影响
       3 讨论
       人类葡萄膜炎多是由自身免疫反应所引起。T淋巴细胞在免疫应答反应中被抗原刺激活化后进行增殖、分化，成为效应细胞，在神经- 内分泌- 免疫网络调节下发挥正常的免疫功能。而T淋巴细胞被活化，发挥免疫功能之后，不能被有效清除，引起局部炎细胞及炎症介质等浸润，被认为是炎症发作和迁延的原因之一。人类葡萄膜炎与动物葡萄膜炎虽然在表现和病理上有很大的相似性，但是在临床病程上则有显著差别，人类葡萄膜炎常表现为一种复发性炎性反应或慢性炎性反应，而动物模型则主要表现为一种急性自限性炎性反应。为揭示二者之间的差异，Yang等[1，3，6，7]做了一系列实验，对内毒素诱导的葡萄膜炎和光感受器间维生素A类结合蛋白诱导的葡萄膜炎研究发现，炎性细胞一进入眼组织即迅速发生凋亡，而人类葡萄膜炎患者的淋巴细胞对凋亡有相当高的抵抗性，对与凋亡相关分子的进一步研究发现，患者的淋巴细胞Fas、FasL表达不平衡，此种不平衡导致了二者不能有效地作用，因而不能使这些细胞发生凋亡，这些细胞的长期存在是人类葡萄膜炎复发和慢性化的基础。
       我省著名眼科前辈陈达夫教授将传统的中医理论与现代医学知识相结合，建立了内眼结构与六经相属学说，认为虹膜、睫状体、视网膜都属于足厥阴肝经，眼内一切色素属于足少阴肾经，因而葡萄膜炎发病与肝肾相关[8]。其长期临床应用的滋肾清肝中药补肾明目口服液在控制慢性葡萄膜炎病情中取得显著疗效，一直沿用至今。
       本研究结果表明，不论葡萄膜炎患者还是健康人，其外周血淋巴细胞都有Fas和Fasl的表达。葡萄膜炎患者淋巴细胞上Fas的表达明显高于健康人(P<0.05)，而FasL表达相对不足，并且患者淋巴细胞凋亡率低于健康人(P<0.05)，这与籍莉等[9]针对慢性葡萄膜炎及慢性复发性葡萄膜炎的一系列研究结果一致。推测这些活化的Fas阳性细胞不能通过Fas/FasL系统介导的凋亡途径清除，导致葡萄膜炎患者体内大量活化的淋巴细胞长期存在，从而引起疾病的复发和炎症的迁延。
       此项实验结果表明，补肾明目含药血清体外可以减少葡萄膜炎患者Fas的表达，增加FasL的表达，通过调整Fas/FasL系统的平衡性，从而促进活化的淋巴细胞通过Fas/FasL介导的途径凋亡，进而达到延缓葡萄膜炎患者发作间歇，降低炎症反应的作用。实验中发现补肾明目含药血清的这一效应在10%、20%含药血清组体现较为明显，5%含药血清组则没有明显差别，说明中、高浓度的含药血清治疗效果更佳。
       【参考文献】
         　[1] Yang P，Ji L，Zhou H，et a1.Disturbed expression of Fas/FasL on c and c T cells in Behcets disease， Vogt-Koyanagi-Harada syndrome and Idiopathic anterior uveitis[J]. Ocul-Immunology andInflammation，2001，9：185.
       
       [2] 陈 玲，杨培增，周红颜，等.伏格特一小柳一原田综合征患者外周血淋巴细胞Fas和FasL mRNA的表达[J].中华眼科杂志，2004，40：507.
       
       [3] Yang P，Chen L，Zhou H ，et a1. Resistance of lymphocytes to Fas-mediated apoptosis in Behcets disease and Vogt-Koyanagi-Harada syndrome[J].Ocul Immunol Inflamm，2002，10：47.
       
       [4] 杨培增.临床葡萄膜炎[M].北京：人民卫生出版社，2004：43.
       
       [5] 曾庆华.中医眼科学[M].北京：中国中医药出版社，2007：177.
       
       [6] 杨培增.葡萄膜炎的研究进展[J].中华眼科杂志，2005，41(12)：1149.
       
       [7] Yang PZ， Herzberg NH， Zhou HY， et al. Apoptosis of infiltrating cells in experimental autoimmune uveoretinitis[J].Chin Med J，2000，113: 643.
       
       [8] 罗国芬.陈达夫中医眼科临床经验[M].成都：四川科技出版社，1985：47.
       
       [9] 籍 莉，杨培增 ，孔庆瑜，等.Fas/ Fasl 抗原在葡萄膜炎患者外周血T 淋巴细胞上的表达[J].眼视光学杂志，2001，3(4)：210.