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       【摘要】 
       目的探讨板栗毛壳水提液对大鼠脑缺血再灌注损伤后羟自由基(·OH)、一氧化氮(NO)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响。方法采用“四血管阻断法”建立脑缺血再灌注动物模型，利用分光光度法测定大鼠脑、肝、肾、心等组织中·OH、NO含量和GSH-Px活性的变化。结果与模型组相比，给药组大鼠各组织中·OH和NO的含量显著降低(P<0.05)，而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性明显提高(P<0.05)。结论板栗毛壳水提液可预防性降低自由基代谢造成的机体损伤，提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
       【关键词】  板栗毛壳; 脑缺血再灌注; 羟自由基; 一氧化氮; 谷胱甘肽过氧化物酶
       板栗毛壳是壳斗科植物板栗Castanea mollissima Blume的总苞。又名栗刺壳、栗黑壳、风栗壳、板栗壳斗等，主产于广东、广西、云南、江西等地，味微甘、涩，性平，具有清热散结、化痰、止血的功效，主治丹毒、肿毒、百日咳、中风不语和便血等疾病[1]。现代研究表明，板栗毛壳含有4-羟基-3-甲酸(4-Hydroxy-3-methoxy benzoic acid)与没食子酸乙酯(Elhyl gallate)等,其水煎液、醇溶物、醋酸乙酯提取物具有极强的抗炎抑菌和抑制胃肠平滑肌作用等生物活性[2，3]，而且低毒。据报道板栗壳色素具一定的抗氧化作用[4]，但板栗毛壳的抗氧化、抗衰老作用迄今未见有报道。本研究将通过观察板栗毛壳水提液在大鼠脑缺血再灌注损伤后对羟自由基(·OH)、一氧化氮(NO)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响，探讨板栗毛壳对急性脑损伤的保护作用。
       1 材料与仪器
       1.1 药物与试剂双缩尿试剂，羟自由基测定试剂，一氧化氮测定试剂，谷胱甘肽过氧化物酶活力测定试剂均为南京建成生物工程研究所产品;板栗毛壳采于广西隆安县那圩镇发立村，经广西中医学院药用植物学教研室刘寿养教授鉴定为壳斗科植物板栗Castanea mollissima Blume的总苞。
       1.2 动物健康SD大鼠,雌性,体质量(200±30)g，由广西中医学院实验动物中心提供。
       1.3 仪器紫外可见分光光度计UV-160(日本shimadzu公司);1411高频小电刀(上海医疗器械高技术公司);江弯-Ⅰ型C通用立体定向器(第二军医大学);TGL-16型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);FSH-Ⅱ高速电动匀浆器(江苏省金坛市医疗仪器);WXH微型旋涡混合器(上海跃进医疗器械厂);可调移液器(上海大龙医疗设备有限公司)。
       2 方法
       2.1 板栗毛壳水提液的制备清洗板栗毛壳,用烘箱在60℃下进行充分干燥,取出捶碎，然后称取干燥的板栗毛壳100 g,用适量纯净水浸泡2 h后(漫过药材表面既可),煮沸30 min,加同量纯净水煮3次,合并水煎液,再浓缩至相当于1 g(生药)/ml。
       2.2 实验分组取健康SD雌性大鼠30只,随机平均分为正常组、模型组和给药组。给药组按1 ml/100 g(相当于1 000 g鼠给10 g生药材)的剂量用板栗毛壳提取液灌胃给药;正常组和模型组按等量蒸馏水灌胃。灌胃1周后进行造模实验。
       2.3 脑缺血再灌注模型的建立模型组和给药组采用四血管闭塞法[5]建立脑缺血模型,具体操作如下:用2%的戊巴比妥钠按45mg/kg腹腔注射麻醉,用立体定向器定位头颅,剥离暴露左右椎动脉,电凝阻断,缝合;再背部定位,分离双侧颈总动脉,挂线结扎,造成完全缺血。15 min后，放开左右颈总动脉，形成脑缺血再灌注模型，常规缝合。3 h后处死大鼠。正常组不做手术。
       2.4 组织匀浆的制备造模到时后，立即断颅处死取脑、心、肝、肾等组织，用0.154 mol/L NaCl冷冻溶液洗净，分离组织包膜，快速用滤纸吸干，准确称重，按1∶9的比例加入0.154 mol/L NaCl的冷冻溶液，在3 000 r/min度下进行匀浆5 min，制成10%的匀浆。用高速低温离心机离心(3 000 r/min，离心 20 min),取上清液置冰箱内4℃保存，备用。
       2.5 蛋白质、·OH、NO和GSH-PX含量的测定分别参照蛋白定量(双缩脲法)测试盒、·OH测试盒、NO测试盒(化学法)和GSH-PX测试盒说明书进行测定。
       2.6 统计方法及软件数据用±s 表示,采用组间t检验，用中国医学百科统计软件包(PEMS V2.1)进行统计分析。
       3 结果
       3.1 板栗毛壳水提液对大鼠各组织中·OH抑制能力的影响用t检验比较各组大鼠各组织对羟自由基的抑制能力的变化程度。见表1。表1 板栗毛壳水提液对大鼠器官组织匀浆·OH含量的影响由表1数据可知，与正常组相比，模型组的·OH含量明显增大(P<0.05)，提示脑缺血再灌注损伤后使羟自由基含量增加了。而给药组的·OH含量低于模型组(P<0.05)，说明板栗毛壳水提液对损伤机体产生的自由基有一定抑制作用。
       3.2 板栗毛壳水提液对大鼠各组织中一氧化氮(NO)含量的影响表2数据显示,模型组各组织中NO含量显著高于正常组(P<0.05)，提示脑缺血再灌注损伤后NO含量增加了，而给药组各组织中NO含量显著低于模型组(P<0.05)，说明板栗毛壳水提液对脑缺血再灌注损伤后NO含量的增加具有很强的抑制作用。表2 板栗毛壳水提液对NO含量的影响
       3.3 板栗毛壳水提液对大鼠各组织中总GSH-Px活力的影响由表3据可知，与正常组比较，模型组的GSH-Px活力明显降低(P<0.05)，表明脑缺血再灌注损伤后大鼠脑、肝、肾、心组织中的GSH-Px活力显著降低;而给药组比模型组的GSH-Px活力明显升高(P<0.05)，表明灌喂板栗毛壳水提液后，大鼠机体组织的GSH-Px活力显著增大。
       4 讨论
       正常生理状况下生物体内可产生大量的具有生物活性的自由基,机体中的各种抗氧化酶以降解自由基,使细胞免受损害。脑缺血时,脑微血管系统中存在的谷胱甘肽-谷胱甘肽还原酶自由基清除系统含量下降,血管周围有大量自由基产生,超过了抗氧化物质的清除能力,可攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸,导致细胞膜结构和功能的破坏。氧自由基可损伤血脑屏障,促进脑水肿的形成,促进血管内皮粘附分子表达及白细胞和血小板与内皮的粘附,加重再灌注后脑微循环障碍[6]。自由基反应参与了脑缺血后神经细胞的损害过程,是导致迟发性神经元损伤的核心环节[7]。羟自由基(·OH)是一种活性氧自由基，其化学性质非常活泼，可通过氧化细胞膜脂质、蛋白质和核酸而导致细胞功能障碍甚至死亡;脑缺血再灌注期间·OH的来源有[8]:脑内儿茶酚胺尤其是多巴胺的过度释放、ATP等的大量分解及线粒体电子传递链功能障碍。NO作为一种神经毒性分子,NO途径可能产生一种非常重要的氧自由基—硝基过氧化物,从而严重损伤神经元[9]。而GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物,促进H2O2的分解,减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用,保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰及损害, GSH-Px的活性高低可影响大鼠体内抗氧化能力的强弱。表3 板栗毛壳对GSH-Px活力的影响本研究结果显示，板栗毛壳水提液对大鼠脑缺血再灌注损伤后各组织中·OH和NO含量均具有显著的抑制作用(P<0.05，P<0.05)，同时能显著提高谷胱甘肽过氧化物酶活性(P<0.05)。此外，在各指标测定过程中测定结果均非常稳定,重现性好。表明板栗毛壳水提液能够减少大鼠脑缺血再灌注损伤后羟自由基、一氧化氮的产生，提高谷胱甘肽过氧化物酶活性，达到抗氧化保护作用。因此，板栗毛壳水提液可作为一种急性脑损伤的抑制剂，用于防治与自由基有关的疾病。
       【参考文献】
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