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       【摘要】 
       目的观察比较金蒿滴丸提取物纯化前后体外抗流感病毒的作用，为优化工艺提供有效依据。方法观察药物对狗肾传代细胞(MDCK)的毒性作用，计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0);以甲型、乙型流感病毒分别接种狗肾传代细胞(MDCK)，记录药物对病毒致细胞病变(CPE)的影响，计算半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)。结果金蒿滴丸提取物纯化前对甲、乙型流感病毒的直接抑制作用较弱，纯化后对流感病毒的直接抑制作用明显优于纯化前，其对甲、乙型流感病毒的IC50分别为118.88，136.88μg/ml，TI分别为6.4，5.6。结论金蒿滴丸提取物纯化后具有明显的抗流感病毒作用。
       【关键词】  金蒿提取物; 流感病毒
       金蒿滴丸由新疆一枝蒿Artemsia rupestris L.和贯叶金丝Hypericum perforatum两味药材制成，两味药材都具有解毒、抗过敏、抗菌、抗病毒及保肝等功效[1,2]。本文对金蒿滴丸粗提物及大孔吸附树脂纯化后的乙醇洗脱部位，通过体外实验进行抗流感病毒药效对比研究，为金蒿抗流感滴丸的研制及优化工艺提供药效学依据。
       1 材料
       1.1 病毒及细胞株甲型流感病毒(济防90-15)，乙型流感病毒(济防97-13)，狗肾传代细胞MDCK，分别购自中国预防医科院病毒研究所。
       1.2 细胞营养液培养液，含10%小牛血清、0.29 mg谷氨酰胺/ml，100 μg/ml青、链霉素的Eagle"s(MEM)液;维持液，除所含小牛血清为2%外，其他均同细胞培养液。
       1.3 药品
       1.3.1 阳性对照药病毒唑，四川光大制药有限公司生产，批号0806027。
       1.3.2 受试样品金蒿滴丸提取物纯化前样品及纯化后样品均由新疆药物研究所提供。受试样品的制备：
       取新疆一枝蒿和贯叶金丝桃药材，以70%的乙醇提取，提取液减压浓缩至无醇味，真空干燥得浸膏粉，实验前用高纯水配制成16 mg/ml的原药液，过滤除菌后备用，实验时按需要做倍比稀释，作为纯化前样品(G1)。取上述浓缩液调pH值为5，上HPD100大孔吸附树脂柱，用30%乙醇、70%乙醇分别洗脱，合并洗脱液，混匀，低温浓缩并干燥，实验前用高纯水配制成16mg/ml的原药液，过滤除菌后备用，实验时按需要做倍比稀释，作为纯化后样品(G2)。
       1.4 动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：新医动字(新)syxk2003-0001。
       1.5 仪器BHC-1300ⅡA/B3型生物安全柜，苏净集团安泰公司产品;HH.CP-01型CO2培养箱，上海福玛试验设备有限公司产品;XDS-1B倒置显微镜，日本Olympus产品;MDF-382E型超低温冰箱，江苏省金坛市医疗仪器厂产品;立式压力蒸气灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品。
       2 方法
       2.1 测定药物对MDCK细胞的毒性[3]分别将原药液G1、G2和病毒唑用维持液稀释成1∶2，1∶4，1∶8…1∶128共7个浓度，加到接种MDCK细胞并已长成单层的96孔培养板中，100 μl/孔，每稀释度4个复孔，同时设细胞对照。将培养板置37℃ 5% CO2培养箱中培养，每日观察细胞生长情况，确定细胞不出现明显退变的最低稀释倍数为最大无毒浓度(TC0)，并按Reed-Muench法计算50%毒性浓度(TC50)。
       2.2 测定药物对病毒致细胞病变(CPE)的影响[4]取已接种MDCK细胞并长成单层的培养板，吸弃培养液，分别接种100倍的半数组织培养感染剂量(100TCID50)的不同病毒液50 μl，置37℃ 5% CO2培养箱中吸附1 h后，吸弃病毒液，用Eagle,s维持液洗细胞表面2次,设细胞对照组、病毒对照组、病毒唑(取TC0及其以下的3个4倍稀释度共四个浓度)的给药组、金蒿纯化前后样品G1、G2不同浓度(取TC0及其以下的3个2倍稀释度共4个浓度)的给药组，4孔/组。给药组加入不同稀释度的药液，对照组加维持液，100 μl/孔。培养板置37℃，5% CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达4级时记录实验结果。细胞病变按六级标准判断，并按Reed-Muench法计算IC50，TI=TC50/IC50。: 细胞生长正常，无病变出现;±：细胞病变少于整个单层细胞的10%;1 ：细胞病变约占整个单层细胞的25%以下;2：细胞病变约占整个单层细胞的50%以下;3：细胞病变约占整个单层细胞的75%以下;　4：细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
       3 结果
       3.1 药物对MDCK细胞的毒性G1、G2对MDCK细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢，颗粒较多，形态改变、部分细胞破碎脱落。G1、G2对MDCK细胞的毒性作用随着药物浓度的降低而减轻。结果见表1。表1 对MDCK培养细胞的TC0和 TC50
       3.2 药物对病毒致细胞病变(CPE)的影响金蒿滴丸纯化前后样品G1、G2与病毒对照组相比，纯化前样品(G1)对甲、乙型流感病毒的抑制作用较弱;纯化后样品(G2)对甲、乙型流感病毒有明显的抑制作用，其IC50分别为118.88，136.18 μg/ml，TI分别为6.4，5.6。结果见表2～3。
       4 讨论
       近年来，对单、复方中药的抗流感病毒研究在国内日益受到重视，传统中药在防治流感方面有其独到之处。新疆一枝蒿作为新疆地产药材，广泛的临床应用及大量的药理实验表明其具有抗过敏、抗氧化、抗病毒、保肝降酶、调节免疫等作用[5]，目前抗病毒作用已是一枝蒿研究的一个热点，在天然植物中寻求高效低毒的抗病毒成分一直都是研究者关注的课题。纽约大学医学中心研究表明贯叶金丝桃中的金丝桃素在体内外都有很强的抗病毒作用，其作为广谱抗病毒药物，对乙肝病毒、流感病毒、疱疹病毒均有抑制作用[6]。单味药经过配伍或组成复方后，抗病毒范围可能互补、扩大甚至协同[7]，通过更加深入的研究，明确有效成分或有效部位，据此寻求更合理的提取工艺和制剂工艺，开发出疗效更好的相关制剂。　　表2 对病毒致MDCK细胞病变的影响表3 体外抗病毒实验本实验用体外细胞培养的方法，通过药材提取物纯化前后抗流感病毒作用的药效学对比研究，可知金蒿滴丸提取物纯化前抗流感病毒作用较弱，而纯化后有较明显的抗流感病毒作用，因此纯化后的该复方制剂具有明显的抗病毒作用，这为工艺的优化提供了有效的依据。
       【参考文献】
         　　[1] 施正福,范焱.贯叶金丝桃的药理作用研究进展[J].中国现代应用药学志,2000,17(3):190.
       
       [2] 阿丽艳,古力米热.维吾尔药一枝蒿的应用简介[J].中国民族医药杂志,2004,10(4):19.
       
       [3] 陈鸿珊，张兴权,陶佩珍，等.抗病毒药物及其研究方法[M].北京：化学工业出版社，2006，6：475.
       
       [4] 黄祯祥，洪 涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术[M].北京：科学出版社，1990，2：670.
       
       [5] 斯拉甫，阿不都热依木.一枝篙有效部位的药理学研究[J].中国药理与临床，2001，18(3):15.
       
       [6] Pozzolini Mscarfis,Benattiu,aovine M.Interference in Mrrrceu viahility assay in activated macmphIdge celI line[J].AnalBiochem，2003，313(2)：338.
       
       [7] 马振亚.中药抗病毒抗菌作用研究，第1版[M].北京：中国医药科技出版社，2008：74.