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       【摘要】 
       目的研究云南钝顶螺旋藻片中多糖的提取与纯化工艺，并筛选出云南钝顶螺旋藻多糖脱色、脱蛋白的最佳方法。方法正交实验设计优选出提取云南钝顶螺旋藻片中多糖的方法，以提取多糖物质多糖损失率、蛋白质去除率为测定指标，分别考察不同实验方法对多糖脱蛋白、脱色的影响。结果云南钝顶螺旋藻片多糖的最佳提取工艺为：水提温度为80℃,水提时间2 h，固液比1∶15，在此条件下多糖提取率为2.18%，水提温度和固液比是影响多糖得率的主要因素。三氯乙酸脱蛋白法为云南钝顶螺旋藻片多糖脱蛋白的最佳方法，活性炭脱色法对云南钝顶螺旋藻多糖片的脱色效果优于过氧化氢脱色法。结论云南钝顶螺旋藻片粗多糖的纯化，脱色与脱蛋白方法的优化为进一步研究云南钝顶螺旋藻片的生物活性提供了基础。
       【关键词】  正交实验设计; 钝顶螺旋藻片; 多糖; 脱色; 脱蛋白
       钝顶螺旋藻Spirulina platensisl, 简称SP, 是蓝藻门、蓝藻纲、断增藻目、颤藻科中的螺旋藻属低等水生植物。SP是种微藻, 体长约200～ 500 μm，宽仅为5～ 10 μm，因藻体呈螺旋状而得名。在SP的各种生物活性物质中，螺旋藻多糖(简称PSP) 由于具有广泛而复杂的生物学活性而成为目前SP研究的热点之一[1]。
       “复方螺旋藻片(原名“云南天然钝顶螺旋藻片”)”是云南大理学院研制的新型功能性保健食品[2]，已获国家发明专利(专利号：ZL96107910.X)。研究表明，该保健品具有降低血糖[3]、调节血脂[4]、增强机体免疫力[5]等多种作用。多糖是该制剂的主要活性成分之一。为进一步探讨“复方螺旋藻片”的作用机制，本实验以该保健品为原料，采用正交实验设计对其多糖进行了初步分离纯化并进行含量测定。目前，植物多糖的提取通常采取水提醇沉[6]的方法，得到的多糖产品纯度较低，主要杂质有色素、蛋白质和一些小分子的物质。色素的存在不仅影响多糖的色泽，同时也影响“复方螺旋藻片”多糖的纯度，从而影响其生物活性，阻碍了对多糖的组成及结构与其生物活性关系的理论研究。为此本实验对该制剂中多糖的提取、除杂、脱色等工艺进行研究，并且对不同脱色和脱蛋白方法的效果进行比较和筛选，使粗多糖得到精制，为进一步研究该保健食品的作用机制提供实验研究基础。
       1 材料与仪器
       1.1 药品与试剂复方螺旋藻片(原名云南天然钝顶螺旋藻片)产品，片剂，瓶装(0.4 g/片×50片/瓶)，云南白药集团大理制药厂生产，批号：20081025。由大理学院左绍远教授提供。SephadexG-100凝胶，北京慧易得科技有限公司生产;葡萄糖对照品、牛血清白蛋白为国药集团化学试剂有限公司进口分装;考马斯亮蓝G-250为北京鼎国生物技术有限公司进口分装;其他化学试剂均为国产分析纯。
       1.2 仪器 B600型低速自动平衡离心机(上海医用分析仪器厂);SH-2型磁力搅拌器(北京洪博达科技有限公司);BT-224S型电子分析天平(德国赛多利斯仪器公司);SHZ-3循环水多用真空泵(上海青浦沪西仪器厂);RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚东生化仪器厂);FD-1型冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司);UV 2550型紫外分光光度计(日本岛津苏州仪器有限公司)。
       2 方法
       2.1 云南钝顶螺旋藻粗多糖的提取用电子分析天平称取50g云南钝顶螺旋藻片剂，经研钵充分研磨成细小颗粒状，加入5倍体积的95%乙醇加热(70℃)回流3次，2 h/次，去除脂类和其它醇溶性物质，倾出上层液。药渣于50℃烘箱烘干，15倍水量70℃回流提取2次，每次1 h,过滤，滤液离心(2 000 r/min, 10 min)，上清液浓缩，无水乙醇调含醇量终浓度为80%，4℃静置过夜，离心(3 000 r/min, 20 min)后沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复清洗数次，抽滤后冷冻干燥，得云南钝顶螺旋藻粗多糖。
       2.2 云南钝顶螺旋藻多糖的纯化云南钝顶螺旋藻粗多糖加水溶解至100 ml，加入活性炭，40℃下脱色15 min，滤除活性炭，室温下加入1倍量体积的三氯乙酸，强烈振荡30 min,静置过夜，2 000 r/min离心10 min，取上层水相，上清液用NaOH调pH=7.0,对水透析后减压浓缩至100 ml，重复上述过程3次得浓缩液，无水乙醇调含醇量为80%，4℃静置过夜，离心后沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复清洗数次，抽滤后冷冻干燥，得除蛋白精制多糖。低温烘干得多糖粉末，加水溶解至10 ml，经SephadexG-100凝胶柱分离，蒸馏水洗脱，采用蒽酮-浓硫酸法定性，分段收集洗脱液，乙醇沉淀，干燥后得纯化后的云南钝顶螺旋藻多糖。
       2.3 云南钝顶螺旋藻粗多糖的脱色方法
       2.3.1 过氧化氢脱色取经脱蛋白多糖溶液(0.5 mg/ml)，以氨水调至pH=9.0，分别加入30%过氧化氢适量，使其溶液中的终浓度分别为0.5%，1%，1.5%，40℃保温15 min。
       2.3.2 活性炭脱色活性炭经重蒸水清洗过滤，干燥(120℃，8h)冷冻备用。取经脱蛋白多糖溶液(0.5 mg/ml)，分别加入0.5%、1%、1.5%的活性炭，40℃保温15min。
       2.4 云南钝顶螺旋藻粗多糖脱蛋白的方法水提醇沉法得到的粗多糖含有一定量的蛋白质，本实验以蛋白质去除率及多糖损失率为指标比较三氯乙酸-正丁醇法、三氯乙酸法和Sveage法3种脱蛋白方法。蛋白脱除率(%)=[(脱蛋白前蛋白质量 -脱蛋白后蛋白质量)/脱蛋白前蛋白质量]×100%多糖损失率(%)=[(脱蛋白前多糖质量-脱蛋白后多糖质量)/脱蛋白前多糖质量]×100%
       2.4.1 三氯乙酸-Sevage 法取粗多糖溶液( 015 mg/ml) 50 ml，加入多糖溶液体积1倍量10%三氯乙酸和1 /5体积的Sevage试剂(氯仿∶正丁醇= 4∶1) ,搅拌1 h, 4 000 r/min离心10 min，分出上清液,测定蛋白质和多糖含量。
       2.4.2 三氯乙酸法取粗多糖溶液(0.5 mg/ml)50 ml，加入1倍量的20%三氯乙酸，搅拌30 min，静置过夜，4 000r/min离心10 min，分出上清液，加1 mol/L NaOH调pH至7.0，乙醇沉淀后测定其蛋白质和多糖含量。
       2.4.3 Sevage法取粗多糖溶液(0.5 mg/ml)50 ml，加入1/4体积的Sevage试剂(氯仿：正丁醇= 4∶1)，搅拌1.5 h，倒入分液漏斗中静置1.5 h，分出水层，测定蛋白质和多糖含量。
       2.5 多糖及蛋白质含量测定方法 多糖含量采用蒽酮-浓硫酸法[7]，以葡萄糖为标准品绘制标准曲线。蛋白质含量采用考马斯亮蓝法[8]，以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线。钝顶螺旋藻粗多糖提取率(%)=[粗多糖质量(g)/原料质量(g)] ×100%
       3 结果
       3.1 云南钝顶螺旋藻多糖提取的工艺根据单因素初步实验，影响云南钝顶螺旋藻多糖提取率的主要因素有水提温度、水提时间、固液比，为综合分析各因素的影响，按3因素3水平表采用L9(34)正交实验设计，各因素水平(见表1)每个实验重复3次，确定最佳提取工艺,对正交实验所得的最佳提取工艺进行验证性实验。表1 因素水平表由表2可知，影响云南钝顶螺旋藻多糖提取率的各因素排列为水提温度(A)>水提时间(B)>固液比(C)，水提温度对云南钝顶螺旋藻多糖提取率的影响达到显著水平。根据正交实验的观点，只选取有显著性意义因素的最好水平搭配，确定出最佳方案。而对于不显著性的因素，原则上可以由实际条件酌情处理。综合各因素K值和极差方差分析比较，得出云南钝顶螺旋藻多糖的最佳工艺为：水提温度80℃，水提时间2 h，固液比1∶15，此工艺条件下云南钝顶螺旋藻多糖的提取率为2.18%，多糖含量为13.65%。表2 正交实验设计结果
       3.2 云南钝顶螺旋藻多糖脱色方法的比较脱色后的溶液于200～700 nm下进行紫外分光光度法扫描，检测脱色效果，葡萄糖溶液为对照品进行比较，以多糖损失率为指标考察不同浓度过氧化氢和活性炭脱色的效果[9]。比较不同浓度活性炭脱色和过氧化氢脱色效果及多糖损失率。结果见表3。表3 不同脱色方法对云南钝顶螺旋藻多糖含量的影响从表3可知，活性炭对云南钝顶螺旋藻多糖的吸附能力较强，其脱色效果比过氧化氢好，多糖损失率较低。脱色剂种类以及浓度对多糖脱色效果显示出差异，而用量升高时候多糖损失率明显增加，通常取0.5%～1%的活性炭能取得满意的效果。
       3.3 云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白方法的比较多糖中的游离蛋白质可用蛋白质沉淀剂如三氯乙酸、鞣酸等除去，少量蛋白质可选用Sevage法除去[9]。以蛋白质去除率、多糖损失率为指标比较三氯乙酸-正丁醇法、三氯乙酸法和Sevage法脱蛋白的效果，优化筛选出适合工业生产的简单、高效的云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白方法。比较上述3种方法脱蛋白的效果。结果见表4。表4 不同方法对云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白效果比较从表4可知，3种脱蛋白质方法中，蛋白质去除率最高，效果最好的为三氯乙酸-Sevage法，蛋白质去除率达60.26%，但该方法处理后的多糖损失率也较高，达到11.21%;采用Sevage法脱除蛋白质的效果较差，蛋白质去除率仅为17.85%，需要多次使用，而每次使用Sevage试剂除去蛋白质的变性胶状物时，不可避免溶有多糖，造成多糖损失率达63.51%。三氯乙酸作为一种有机酸，可以使得样品中的蛋白质因为有机酸而变性沉淀，采用三氯乙酸法去除蛋白质(52.03%)的同时多糖损失率(2.85%)较低，综合考虑蛋白质去除率和多糖损失率两个指标，三氯乙酸法是较理想的脱蛋白方法。
       4 讨论
       实验中通过正交实验设计水提醇沉法提取云南钝顶螺旋藻多糖，提取过程中考察了不同的水提温度(A)、水提时间(B)和固液比(C)对多糖提取量的影响，以最小的RB做误差估计，RA、RC分别是RB的3.9 倍和3.3 倍。因此，A、C 是影响多糖得率的主要因素，B 则是次要因素， 结合各因素的K值(越大越好)可得优选水提温度80℃，水提时间2 h，固液比1∶15进行提取，多糖产率较高。此外，在多糖的提取过程中还发现，冰乙醇用量越大，沉降时间越长，多糖沉淀越彻底，得率越高。实验中控制溶液的醇浓度约80%，过夜沉降。温度升高，不利于多糖的沉降，故选择4℃冰箱中冷藏静置。
       提取出来的云南钝顶螺旋藻粗多糖呈绿色，色素的存在影响色泽和纯度，而多糖进一步分离纯化往往选用离子交换色谱法，残留的色素会降低离子交换树脂的交换能力，因此脱色在多糖纯化过程中有着非常重要的作用。此外，云南钝顶螺旋藻粗多糖中蛋白质的存在会影响对多糖生物活性的进一步研究，因此有必要进行脱色和脱蛋白方法的研究。
       过氧化氢脱色的原理是其在受热过程迅速分解，产生初生态氧而破坏有色物质，对多糖的脱色效果较活性炭差且多糖损失率较高。活性炭为黑色细微粉末，无毒、无臭、无味，具有多孔结构，能吸附糖液中的色素物质，但同时也会吸附掉部分多糖，造成多糖的组分损失，所以在选择脱色剂用量上，并不是用量越高越好，而应同时考虑脱色效果与多糖损失两者的综合效应。此外，实验还比较了同种方法对云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白前后脱色效果。脱蛋白后进行脱色，溶液透光率明显提高，用1.5%活性炭40℃保温15 min，糖溶液呈透明状。蛋白质的存在影响了色素的去除，这可能与色素的性质有关，推测其大多为结合色素。
       多糖主要以两种形式存在，一是以纯糖链，另一种是糖链与肽链结合，形成糖肽或糖蛋白，多糖脱蛋白并不是彻底去除蛋白质，主要是去除游离蛋白质，因此在选择脱蛋白方法时应该注意避免多糖-蛋白质复合物的降解，从而造成多糖-蛋白质特有的生理活性下降。粗多糖中蛋白质的去除通常采用4种方法即酶法、Sevage法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法[10] 。本文对三氯乙酸-Sevage法、三氯乙酸法和Sevage法3种脱蛋白方法进行了比较，结果表明三氯乙酸法对云南钝顶螺旋藻多糖的脱蛋白效果较好，而且多糖损失率较小。因此，选用三氯乙酸法进行3次脱蛋白能够较好的去除蛋白质，但在一定程度上也有可能造成一部分多糖-蛋白质复合物的损失，是否影响到多糖的活性，有待于进一步研究。
       【参考文献】
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