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       【摘要】 
       目的建立一种简单有效的制备五味子醇甲的新方法。方法以北五味子的干燥成熟果实为原料，依次通过乙醇提取、液-液萃取、硅胶柱层析、大孔吸附树脂柱层析、反复重结晶等步骤，可制备高纯度的五味子醇甲。结果通过上述方法，能够快速、有效的制备高纯度五味子醇甲。结论提供了一种制备五味子醇甲的新方法。
       【关键词】  五味子; 五味子醇甲; 大孔吸附树脂; 重结晶; 方法
       中药五味子是五味子科，五味子属Schisandra植物五味子Schisandra chinensis和华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd. Etwils的干燥成熟果实，商品名分别为“北五味子”和“南五味子”。北五味子味酸、甘，性温，归肺、心、肾经。《神农本草经》将北五味子列为上品，其具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效，主治久咳虚喘、遗精、滑精、遗尿、尿频、久泻不止、盗汗、津伤口渴、短气脉虚、内热消渴、心悸失眠等病症，盛产于辽宁、吉林、黑龙江、河北等地。药理研究表明，五味子在诸多方面都有较好的疗效，临床应用相当广泛，尤其是对四氯化碳、硫代乙酸胺等造成肝损害引起的SGPT(血清谷丙转氨酶)升高有降低作用，也能使肝炎患者的高SGPT降低，还可减轻中毒肝损伤的物质代谢障碍，具有轻度升高肝糖元、减轻肝细胞变性，减轻中毒致病因子对肝细胞线粒体和溶酶体的破坏，进而促进肝细胞内蛋白质合成的作用[1]。现代科学研究证明，五味子中富含挥发油、有机酸、维生素、木脂素、三萜、倍半萜及多糖等多种化学成分[2]。其中的木脂素类化合物为其有效成分，五味子醇甲则为主要有效成分，因其在植物体内常与大量树脂状物共存，在溶剂处理过程中容易树脂化，为传统溶剂法纯化五味子醇甲的难点[3]，一般制备过程不易提取出来，这给工业生产造成了极大的困难。虽然我国学者在五味子临床疗效、有效成分提取鉴定、药理作用及植物资源等方面已作了大量的研究，但涉及到具体有效成分的提取分离工艺则比较杂乱无章[4]。因此，研究能够降低生产成本、提高有效成分制剂质量的提取工艺就显的尤为迫切和重要。
       AB-8 型大孔吸附树脂是工业化生产中常用的一种分离材料，具有吸附性能好、吸附效率高、再生简单、解吸附方便等优点，是有效成分在工业制备中的首选材料，将其用于五味子醇甲制备的相关报道相对较少，作者在前期研究中发现，采用传统的正相硅胶柱层析很难富集和制备高纯度的五味子醇甲，本研究报道作者选用大孔吸附树脂(AB-8型)作为分离材料旨在研究将大孔吸附树脂应用于分离脂溶性有效成分的分离纯化方法，本研究报道采用乙醇-水梯度洗脱，能较好地去除杂质，达到制备高纯度五味子醇甲的目的。本方法不仅简化了五味子醇甲的制备过程，降低了工艺成本，而且能使产品的收率和质量都明显提高，为工业上扩大生产提供了可靠的科学依据。
       1 材料与仪器
       1.1 材料甲醇(色谱纯，美国天地试剂公司 Tedia Company Inc);水(自制超纯水);其他试剂均为工业重蒸;柱层析硅胶(40-80 目和200-300 目)和薄层层析硅胶板(GF254)均为青岛海洋化工厂生产;大孔吸附树脂(AB-8 型，购于南开大学化工厂);北五味子(购于贵州省贵阳市花果园药材市场，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定其为北五味子的成熟干燥果实);五味子醇甲对照品(贵阳市药检所提供，纯度大于 99.9 %)。
       1.2 仪器电子分析天平(梅特勒-托利多 Mettler Toledo PL303);高效液相色谱仪Agilent HP1100 系列：四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，Chemstation 化学工作站;色谱柱为Kromasil-C18(5 μm，4.6 mm× 250 mm)柱;超声波清洗机 KQ-100 型(昆山市超声波仪器厂);粉碎机(长沙宏卫科技制药机械厂)。
       2 方法与结果
       2.1 大孔吸附树脂的预处理大孔吸附树脂经2 % NaOH 浸泡洗脱后，用95%乙醇浸泡、60 ℃洗脱，洗脱流速为2 BV·h-1，乙醇用量为3～4 倍柱床体积。
       2.2 供试品的制备准确称取北五味子干燥成熟果实1.00 kg，粉碎后用85 % 的工业酒精加热回流提取4次，提取时间分别为3，2，2，2 h，合并提取液减压浓缩至乙醇含量低于5 %，共得到提取液1 260 ml，提取液用醋酸乙酯萃取 3 次，萃取液经浓缩得浸膏89.05 g，将其通过正相硅胶柱层析(样品和200～300目硅胶的重量比为1∶5)，采用石油醚-醋酸乙酯(0∶1～1∶0)梯度洗脱，薄层层析跟踪检测(以五味子醇甲对照品对照)，合并含有五味子醇甲的部位，减压浓缩可得供试品共 10.16 g。
       2.3 大孔吸附树脂柱层析
       2.3.1 供试品的吸附将上述供试品(10.16 g)用无水乙醇溶解后吸附于预处理过的 65 g 干燥大孔吸附树脂上，常温下自然挥干备用。
       2.3.2 装柱将预处理好的10 g大孔树脂装于玻璃层析柱(7 cm×50 cm)中，再将上述已吸附于大孔吸附树脂上的供试品置于其上，并使上层平面尽量水平。
       2.3.3 洗脱采用乙醇-水梯度洗脱(0%，5%，10%，15%，20%.....)，每个梯度用4～5 倍柱体积的溶液洗脱，洗脱液用薄层层析跟踪检测(以五味子醇甲对照品对照)，五味子醇甲在20 %乙醇-水洗脱液中被检测到，纯度较好，将洗脱液中仅含有五味子醇甲的部位合并并浓缩，可制得五味子醇甲粗品3.98 g。
       2.3.4 重结晶 将上述五味子醇甲粗品(3.98 g)加入醋酸乙酯(5 ml)加热溶解后，边振荡边滴加石油醚(12.5 ml)至浑浊。随即将上述混合液放置冰箱过夜即可得到五味子醇甲晶体，过滤得到五味子醇甲纯品，反复重结晶两次可得到高纯度五味子醇甲3.15 g(纯度大于 97 %)。见图1。图1 五味子醇甲分离纯化工艺总流程图
       2.4 纯度检测 将反复重结晶两次制备得到的五味子醇甲与其对照品分别通过高效液相色谱检测其纯度。见图2。
       2.4.1 分析条件色谱柱 Kromasil-C18(Kromasil，5 μm，4.6 mm× 250 mm);流动相为甲醇-水(70∶30);流速为1.0 ml/min，柱温 25 ℃，检测波长 250 nm。
       2.4.2 五味子醇甲对照品溶液的制备 准确称取五味子醇甲对照品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10.0 ml容量瓶中，配置成1 mg/ml的五味子醇甲对照品溶液。
       2.4.3 供试品溶液的制备准确称取上述经过两次重结晶制备的五味子醇甲供试品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10.0 ml容量瓶中，配置成1 mg/ml的五味子醇甲供试品溶液。A-五味子醇甲对照品 B-供试品 1. 五味子醇甲图2 五味子醇甲对照品和供试品的 HPLC 图表1 五味子醇甲对照品和供试品的保留时间及峰面积检测样品保留时间t/min峰面积 五味子醇甲对照品6.7962110.80 五味子醇甲供试品6.8702100.49由表1可知，通过上述制备工艺得到的五味子醇甲的纯度可达到97.0 % 以上。
       3 讨论
       目前使用大孔吸附树脂分离五味子醇甲的常用方法中，大都是采用五味子的醇提溶液直接进行柱层析。因提取液的浓度是影响大孔树脂吸附性能的重要因素之一，浓度越低越有利于有效成分的富集，但浓度低时，样品的吸附时间就需要延长，严重影响了生产效率，而且高浓度的五味子提取液中含有大量鞣质、色素、无机盐、多糖等水溶性杂质，这会使提取液处于混悬状态，悬浮的微粒会堵塞大孔吸附树脂表面的微孔，杂质的存在也大大降低了五味子醇甲的相对浓度，严重影响了吸附性能。本研究方法将五味子提取液经醋酸乙酯萃取，水溶性杂质大多处于水溶液层，而五味子醇甲等脂溶性成分会被富集于醋酸乙酯层，再经硅胶柱层析，能进一步避开水溶性杂质，从而达到富集五味子醇甲的目的。与传统的五味子提取液直接通过大孔吸附树脂柱层析相比，本方法能大大减少大孔吸附树脂的用量，进而可以降低成本提高效率。
       五味子醇甲属于联苯环辛二烯类木脂素成分，是一类脂溶性小分子化合物，通过硅胶柱层析富集得到的含有五味子醇甲的样品的水溶性很差，很难将其制备成均匀的水溶液直接吸附于大孔吸附树脂，从而无法充分利用大孔吸附树脂材料的优点达到分离五味子醇甲的目的。本研究方法将含五味子醇甲的富集部位用无水乙醇直接溶解，然后将其吸附于干燥的大孔吸附树脂分离材料上，可以充分利用大孔吸附树脂材料的优越性，快速有效的制备五味子醇甲。
       本制备方法中，在进行大孔吸附树脂柱层析时，应采用尽可能多倍柱床体积的蒸馏水进行洗脱，可除去大量水溶性杂质;同时注意用薄层层析随时检测洗脱液中五味子醇甲的纯度。本研究报道中，用20% 的乙醇-水溶液洗脱大孔吸附树脂，可直接制备五味子醇甲粗品，再通过重结晶可制得高纯度五味子醇甲。
       【参考文献】
         　[1] 韩景兰，李晓萍，刘翠红. 保肝中药研究进展[J].中医药信息，2001，18 (2)∶22.
       
       [2] 郑占虎，董泽宏，佘 靖. 中药现代研究与临床应用，第1卷[M].北京：学苑出版社，1997∶148.
       
       [3] 王彦涵，高建平，陈道峰. 高效液相色谱法测定五味子属药用植物木脂素的含量[J].中国中药杂志,2003，28(12)∶1156.
       
       [4] 应国清，俞志明，单剑峰，等. 北五味子有效组分的研究进展[J].河南中医，2005，25(6)：84.