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       【摘要】 
       目的建立碱水解法提高黄芪药材中黄芪甲苷收率的最佳工艺。方法以黄芪甲苷的收率为考察指标，采用正交实验对黄芪甲苷的提取工艺进行优选。考察NaOH浓度、水解时间及料液比对黄芪甲苷收率的影响，采用高效液相色谱-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)测定其含量。结果NaOH溶液的浓度对黄芪甲苷的收率起主要作用，最佳工艺条件为：NaOH溶液的浓度为0.100 mol·L-1，室温静置水解2 h，黄芪药材与碱溶液的料液配比为1∶12，黄芪甲苷的含量约是未经碱水解组的16.4倍。结论碱水解法可显著提高黄芪药材中黄芪甲苷的含量。方法简便易行，实用价值高，为工业化生产提供了依据。
       【关键词】  碱水解法; 黄芪; 黄芪甲苷; 正交试验
       黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge的干燥根。黄芪皂苷是黄芪的主要药效物质之一，黄芪皂苷大部分是以环黄芪皂醇为苷元的皂苷，黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ)为其主要成分[1]，常作为黄芪药材及其制剂的质量控制定量的指标。药理研究表明，黄芪甲苷具有强心护心、保护神经系统及内皮屏障功能、改善血液流变学、调节机体免疫功能、抗衰老、抗胃溃疡等功能，此外，还具有降血压、镇痛镇静、促进胰岛素分泌等作用[2]。黄芪甲苷虽然药理作用显著，但其在黄芪药材中的含量很低，提取分离较困难，使其应用受到极大的限制。本研究利用皂化反应原理，在NaOH作用下将环黄芪醇皂苷转化为黄芪甲苷，通过正交实验优选黄芪甲苷转化的最佳条件，提高黄芪甲苷的收率，为黄芪甲苷单体制剂的研制开发奠定研究基础。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，Alltech 2000ES型蒸发光散射检测器，AT-330柱温箱(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，XWK-3A空气泵(天津市华生分析仪器厂);SZ-93自动双重纯水蒸馏水器(上海强运科技有限公司);BP-211D电子分析天平(德国赛多利斯公司);KS-600D超声清洗机(宁波科生仪器厂);W2-100旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);PHS-25型酸度计(杭州亚美电子仪器厂)。
       1.2 试药黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110781-200613);黄芪药材(购自天津市药材公司，批号为Y0805267，由天津医科大学生药学教研室周晔教授鉴定，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部要求);AB-8型大孔吸附树脂(南开大学树脂厂);乙腈(天津康科德科技有限公司，批号：080426)色谱纯，氢氧化钠为分析纯;流动相用水为重蒸水。
            2 方法与结果
       2.1 色谱条件及系统适用性实验色谱柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相：乙腈-水(34∶66);体积流量：1.0 ml·min-1;柱温：35 ℃;漂移管温度：105 ℃;载气流量：2.5 L·min-1;压力：0.4 MPa;进样量：10 μl。此色谱条件下，黄芪甲苷色谱峰与样品中其他组分色谱峰可达基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数以黄芪甲苷峰计不低于4 000。
       2.2 黄芪药材提取液的制备称取黄芪药材200 g，置于圆底烧瓶中，各次加乙醇量分别为药材干重的10，8，8倍，90 ℃水浴回流提取3次，各次回流时间分别为2，1.5，1 h。每次回流后趁热过滤，滤液合并浓缩后定容至500 ml，备用。精确吸取上述提取液5 ml，按设定的实验条件进行水解后，调节pH至中性，上AB-8型大孔吸附树脂，流出液重复上样一次，用3 BV蒸馏水洗脱树脂，再用4 BV 70﹪乙醇洗脱树脂，收集70﹪乙醇洗脱液，于旋转蒸发仪减压浓缩近干，用70﹪乙醇溶解并定容于10 ml量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得黄芪药材样品液。a.黄芪甲苷对照品;b.碱水解前样品;c.碱水解后样品;1.黄芪甲苷图1 黄芪甲苷标准品及黄芪药材提取液碱水解前后的HPLC图
       2.3 方法学考察
       2.3.1 线性关系的考察准确称取经减压真空干燥至恒重的黄芪甲苷对照品24.7 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别精密吸取黄芪甲苷对照品储备液0.25，0.5，1，2，4，6，8 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别精密吸取上述溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件测定黄芪甲苷的峰面积，以黄芪甲苷进样量(μg) 的自然对数值为横坐标(X)，以峰面积的自然对数值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，并计算回归方程，Y=1.376 8X+12.829，r=0.999 8。黄芪甲苷在0.247～7.904 μg范围内具有良好的线性关系。
       2.3.2 精密度实验精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定黄芪甲苷峰面积值RSD为1.02﹪(n=6)，表明仪器的精密度良好。
       2.3.3 稳定性实验取同一份碱水解工艺制备的黄芪药材供试液，于0，2，4，8，12，24 h分别进样，测定黄芪甲苷峰面积值RSD为1.34﹪(n=6)，表明黄芪药材供试液在24 h内稳定。
       2.3.4 重复性实验精密吸取6份黄芪药材提取液各5 ml至50 ml圆底烧瓶中，按照相同的碱水解工艺条件制备黄芪药材供试液，测定并计算黄芪甲苷的含量，RSD为1.68﹪(n=6)，表明本处理方法制备黄芪甲苷的重复性良好。
       2.3.5 加样回收率实验取经碱水解工艺制备的已知黄芪甲苷含量的供试液2.5 ml至10 ml量瓶中，共9份，每份分别按相当于碱水解后黄芪供试液中黄芪甲苷含量的80﹪，100﹪，120﹪加入黄芪甲苷对照品溶液，加70﹪乙醇定容至刻度，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，测定并计算黄芪甲苷的回收率。结果表明，黄芪甲苷的平均回收率分别为98.26﹪，100.21﹪和97.53﹪，RSD分别为1.45﹪，1.22﹪和1.03﹪。
       2.4 正交实验法优化黄芪药材的碱水解工艺在考察了NaOH浓度，碱水解时间和料液比等单因素对黄芪甲苷转化率影响的基础上，对上述因素水平设计L9(34)正交实验，以每克黄芪生药中含有黄芪甲苷的量(mg)作为评价指标，筛选最佳工艺。各因素水平见表1。表1 正交实验因素水平表L9
       2.4.1 正交实验样品的制备及测定 精确吸取“2.2”中未经碱水解的黄芪提取液5 ml，按表2正交实验条件进行水解后，继续按“2.2”项下操作，每次实验平行2份。照“2.1”项下色谱条件以外标两点法对数方程计算黄芪甲苷的含量。结果见表2。表2 正交实验结果由表3可知，因素A(NaOH浓度)对黄芪中黄芪甲苷的收率具有显著性影响(P< 0.05);因素B(水解时间)和因素C(料液比)对黄芪甲苷的收率无显著影响。因此，因素A为主要因素，因素B和C为次要因素，该结论与直观分析法是一致的。因此，结合实际生产，本实验的最佳搭配为A3B2C3，即浓度0.100 mol·L-1的NaOH室温静置水解2 h，料液比为1∶12。表3 方差分析表
       2.4.2 碱水解工艺的验证实验为进一步考察上述最佳工艺的稳定性及合理性，将药材量放大10倍，即取相当于20 g黄芪药材的提取液进行实验，按照该工艺进行重复性实验3次，随行进行非水解空白组。结果见表4。表4 最佳工艺验证实验结果由表4可以看出，验证实验中黄芪甲苷的含量均高于正交实验各组的含量，经过最佳碱水解工艺水解后的黄芪甲苷含量比未经碱水解组明显增高，约是未经碱水解的黄芪皂苷样品中黄芪甲苷含量的16.4倍，说明本实验确定的黄芪皂苷的最佳碱水解工艺稳定可行，对于黄芪甲苷的生产具有很大的实用价值。
       2.4.3 碱水解前后黄芪总皂苷的含量[3]精密称取未经碱水解和碱水解后提取所得黄芪皂苷粗品各约12.5 mg，用无水乙醇超声溶解并定容于25 ml量瓶中，过滤，取滤液作为样品液。精密吸取0.3 ml样品液，各加无水乙醇至0.5 ml，再分别加入0.5 ml 8%香草醛无水乙醇试剂，置于冰浴中缓缓加入5.0 ml 72%(V/V)的硫酸，旋涡混匀2 min，放入62℃水浴中，保温30 min，取出，置冰浴冷却10 min，摇匀，立即于波长540 nm处测定吸光度，随行试剂空白，测定3次，每个样品平行做3份。　　表5 碱水解前后黄芪总皂苷的含量由表5可以看出，黄芪皂苷碱水解前后黄芪总皂苷的含量变化不大，采用配对t检验，两者的差异无统计学意义，尚不能认为黄芪总皂苷碱水解前后的含量有变化。说明该方法不影响黄芪总皂苷的含量，而是提高了活性较强的黄芪甲苷的含量。
       3 讨论
       国内外学者[1]对黄芪中黄芪皂苷作了深入的研究，已分离鉴定了数十种黄芪皂苷，其中大多数皂苷以环黄芪皂醇为苷元，以配糖体部分不同而分类，黄芪甲苷糖体3个位置均连着-OH，其它环黄芪醇皂苷的配糖体上连接-OH或-OAc，本研究的皂化反应原理就是将黄芪中的环黄芪醇皂苷转化为黄芪甲苷，从而提高黄芪中黄芪甲苷的收率及药用价值。
       在设计正交实验之前，本文对黄芪皂苷的水解方法进行了筛选，分别采用了加热回流法和室温静置法进行黄芪提取液的碱水解，经过t检验，结果表明，加热回流法与室温静置水解法对黄芪提取液中黄芪甲苷的收率的差异无统计学意义，为节约成本消耗，更适用于工业生产的需要，本研究选用了室温静置水解法对黄芪提取液进行黄芪皂苷的水解。
       《中国药典》(2005年版)[4]中对黄芪甲苷含量测定的前处理中，采用了氨试液洗涤正丁醇萃取液，以使黄芪中黄芪甲苷的含量达到测定的要求，但经过反复洗涤，黄芪甲苷的损失率会大大增加，且氨试液刺激性大。有研究[5]采用2%氨液90 ℃水浴回流2 h，用于提高黄芪中黄芪甲苷的收率，但该法中氨试液浓度较大，且加热回流消耗成本高，污染环境。因此，本研究采用了浓度为0.100 mol·L-1氢氧化钠在室温静置碱水解，减少了氨试液对环境的污染，降低成本消耗，该操作方法易于在工业生产中实施。
       【参考文献】
         　[1] 余 灏，杨胜华.黄芪皂甙分析方法研究近况[J].华西药学杂志，1993，8(3)：163.
       
       [2] 石海莲，吴大正，胡之璧.黄芪皂苷甲的研究进展[J].中国药学杂志，2008，43(8)：565.
       
       [3] 李伟东，贾晓斌，蔡宝昌.黄芪总皂苷提取工艺研究1[J].成都中医药大学学报，2004，27(2)：43.
       
       [4] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部 [S].北京：化学工业出版社，2005：212.
       
       [5] 刘 玫，周 晶，张庆伟，等.氨液水解法用于提高黄芪中黄芪甲苷含量的工艺研究[J].中国中药杂志，2008，33(6)：635.
       
       收稿日期：20091130; 修订日期：20100408