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       【摘要】 
       目的研究紫七软肝片对实验性大鼠肝纤维化进程的干预作用。方法用40%CCl4皮下注射和高脂饲料及酒精喂养造成大鼠肝纤维化模型。随机分为空白对照组、模型组、紫七软肝片组、大黄虫丸组和秋水仙碱组，造模同时灌胃给药干预，共6周。实验第4周末及结束以后，各取血清、肝组织，检测Hyp的含量，观察肝组织炎症活动度和肝纤维化程度。结果药物干预后炎症活动度及肝纤维化程度均降低，其中紫七软肝片组6周末时炎症活动度计分最低，肝纤维化度计分与模型组有显著差异(P<0.01)。结论以清化瘀毒为旨立法的紫七软肝片能够减轻大鼠肝组织炎症活动度及纤维化程度;紫七软肝片能够降低大鼠血清HA、PcIII及肝组织Hyp，尤其以肝纤维化早期明显，可能是其抗肝纤维化的作用途径之一。
       【关键词】  清化淤毒; 肝纤维化; 紫七软肝片; 炎症活动度
       中医认为肝纤维化病因主要由于感受湿热疫毒，酒食不节，情志所伤，劳欲过度，以及黄疸、积聚失治所致。其发病机理则为肝、脾、肾三脏功能失调，出现气滞、血淤、水停，积于中焦而成;其病位在肝，涉及脾、肾、三焦，病变多见虚实夹杂，本虚标实。前期临床和实验研究中显示，以清化淤毒为旨立法的紫七软肝片具有保肝、改善微循环和抗肝纤维化等作用[1]。为进一步探讨紫七软肝片及清化淤毒法抗肝纤维化进程中的作用，我们进行了本实验研究。
       1 材料与仪器
       1.1 动物SD大鼠，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证：SCXK(沪)2003-0003;南京中医药大学实验动物中心,实验动物使用许可证：SCXK(苏)2002-0123。
       1.2 药物与试剂①紫七软肝片浸膏粉：处方由紫草、生三七、赤芍、虎杖、黄芪等组成。每毫升浸膏粉相当于生药1g，临用时以蒸馏水配成所需浓度的药液。批号：20070301，由南京中医药大学第一临床医学院医学实验中心提供。②大黄虫丸：广东阳江制药厂有限公司生产，0.72g/10丸，批准文号：国药准字Z 19991101。③秋水仙碱片：西双版纳版纳药业有限责任公司生产，0.5 mg/片。④四氯化碳(CCl4)分析纯：上海化学试剂有限公司生产。⑤透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PcⅢ)放免试剂盒，上海海研医学生物技术有限公司生产，批号：20071201。
       1.3 仪器与设备Vital-200全自动生化分析仪，荷兰产品。DFM-96型10管放射免疫γ-记数仪，合肥众成机电技术开发有限责任公司产品。图像分析系统，瑞医科技产品。
       2 方法
       2.1 肝纤维化大鼠模型的制备参照韩德伍[2，3]等应用CCl4攻击方法制备改进：以40%CCl4橄榄油溶液，首剂5ml/kg，其后3 ml/kg皮下注射，隔3天1次，连续6周(共11次)，同时高脂饲料(89.5%玉米面+0.5%胆固醇+10%猪油)及10%的酒精喂养。
       2.2 实验分组与给药方案100只SD大鼠随机分5组，每组20只，雌雄各半，分笼饲养，空白对照组(K)以普通饲料及自来水自由喂养，不作任何处理;其余所有大鼠给予高脂饮食及10%的酒精喂养。其中模型组(M)造模开始同时灌服生理盐水，紫七软肝片组(Z)造模开始同时灌服紫七软肝片水剂，给药剂量为3 g/kg;大黄虫丸组(D)造模开始同时灌服大黄虫丸汤剂，给药剂量为0.9 g/kg;秋水仙碱组(Q)造模开始同时灌服秋水仙碱，剂量为0.1 mg/kg。所有给药组给药剂量为成人临床剂量，根据体型系数按公式换算出大鼠等效剂量[4]，所有灌胃大鼠均为每日中午灌胃1次，灌胃量为1 ml/100 g，共6周。
       2.3 标本采集在造模第4周末处死半数大鼠，第6末周末即实验结束时处死余下各组所有大鼠。处死取材方法：末次CCl4造模后第3天，禁食12 h，1%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉分离、采血，离心、取血浆或血清后-20℃保存待检;取完整肝脏，并从肝右叶切取3块肝组织，第1块用10%中性甲醛固定，制备石蜡切片，备作常规HE、VG染色，其他两块分别迅速标记放入液氮中保存待检。
       2.4 观察指标及方法①动物一般情况;②肝功能指标;③肝纤维化指标：HA、LN、PcⅢ;④病理组织学观察[5];标本处理：血清可直接取50μl进行测定;肝组织须称取肝组织湿重0.08～0.1 g，按重量体积比加入9倍体积的生理盐水制成10%的组织匀浆，2 500 r/min，离心10 min，直接取大鼠肝组织匀浆50 μl进行测定。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
       2.5 统计学处理应用SPSS13.0软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，结果采用完全随机设计资料的方差分析方法进行，先进行方差齐性检验，方差齐时采用S-N-K法进行均数间两两比较，方差不齐时用Dunnet"s C法进行均数间的两两比较，均P<0.05认为差异有显著性。计数资料组间比较采用等级秩和检验。
       3 结果
       3.1 大鼠死亡情况大鼠死亡主要在造模第3，4周，尤其每次造模第2，3天为甚，模型组总死亡率35%;大黄虫丸组死亡率为25%;秋水仙碱组大鼠死亡率为30%;紫七软肝片组死亡率为15%。
       3.2 大鼠血清肝功能的影响模型组ALT、AST、TBIL、ALP、GGT在不同阶段均显著升高，各给药干预组的的测定指标教模型组偏低。4周末时，紫七软肝片组和秋水仙碱组AST、ALT、TBIL较模型组均有显著差异(均为P<0.05)，大黄虫丸组在降低ALT及TBIL较模型组均有显著差异(P<0.05，P<0.01)。6周末时，紫七软肝片组AST、ALT及TBIL、ALP、GGT较模型组均有显著差异(P<0.05，P<0.01);大黄虫丸组TBIL及GGT较模型组有显著差异(P<0.05)，秋水仙碱组ALT、TBIL、GGT较模型组均有显著差异(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。
       3.3 大鼠血清肝纤维化指标的影响见表1。表1 因素水平
       3.4 大鼠肝组织羟脯氨酸(Hyp)的变化见表2。表2 大鼠肝组织匀浆羟脯氨酸(Hyp)含量的变化
       3.5 大鼠肝脏病理组织学观察在肝脏病理学方面，通过HE和VG两种染色方法观察，发现空白对照组大鼠肝脏组织学均无明显异常。模型组大鼠 4 周主要呈较重小叶内和汇管区的肝细胞脂肪变性、炎症细胞浸润，部分出现桥接坏死，坏死区有较多量的炎细胞浸润;坏死区附近有的肝细胞体积大，核大深染，包浆嗜碱性，纤维化程度在1～3期。给药干预组较模型组炎症减轻，但无显著差异;各组肝纤维化度减轻，其中紫七软肝片组较模型组有显著差异。6周末时，模型组大鼠肝脏脂肪变性较前减轻，中央或局部有中性粒细胞、单核细胞或浆细胞浸润，可见程度不等、范围不一的肝组织坏死区，肝小叶失去正常结构，肝小叶的界板破坏明显，出现窦周纤维化，胶原纤维沿界板破坏处向肝小叶内延伸，多数形成假小叶，处于肝纤维化3～4期或早期肝硬化。三个给药干预组的炎症和纤维化程度明显减轻，其中紫七软肝片组炎症活动度较模型组有显著差异，大黄虫丸组和紫七软肝片组在肝纤维化度积分较模型组有显著差异，紫七软肝片组较秋水仙碱组有明显差异。见表3～4及图1～6。表3 大鼠肝组织炎症活动度计分
       4 总结
       4.1 肝纤维化形成前四周 急性肝损伤时，模型组大鼠肝功能指标ALT、AST、AKP升高明显，紫七软肝片组能升高较慢，TBIL及GGT升高不明显。肝纤维化指标中HA、LN、PcⅢ在模型组中升高明显，紫七软肝片组与大黄虫丸组中HA、PcⅢ轻度偏高，与模型组有显著性差异(均P<0.01);秋水仙碱组中LN、PcⅢ较模型组有显著性差异(P<0.01)。模型组Hyp的含量最高，紫七软肝组较模型组有显著差异(P<0.01)。在病理方面，模型组肝组织损伤较重，纤维化较明显，给药干预组均较轻，肝纤维化度积分秩和检验显示紫七软肝组较模型组有显著差异(P<0.05)。表4 各组大鼠肝组织纤维化程度分级图1 模型组6周末大鼠 图2 模型组6周末大鼠肝组织(HE，40×) 肝组织(V.G，10×)图3 紫七软肝组6周末大鼠 图4 紫七软肝组6周末大鼠肝组织(HE，40×) 肝组织(V.G，10×)图5 大黄虫组6周末大 图6 大黄虫组6周末鼠肝组织(HE，40×) 大鼠肝组织(V.G，10×)
       4.2 肝纤维化形成全程模型组大鼠肝功能指标ALT、AST、AKP升高明显。肝纤维化指标中HA、LN、PcⅢ在模型组中升高明显，较空白对照组有显著差异(均P<0.01);紫七软肝片组与大黄虫丸组中HA、PcⅢ轻度升高，与模型组有显著性差异(P<0.01，P<0.05)。模型组Hyp的含量最高，紫七软肝组及秋水仙碱组较模型组有显著差异(P<0.01，P<0.05)。在病理方面，模型组肝组织损伤最重，纤维化明显，有个别肝硬化，给药干预组均有改善，肝纤维化度积分秩和检验显示紫七软肝片组、大黄虫丸组及秋水仙碱组较模型组有显著差异(P<0.01或P<0.01，P<0.05)，且紫七软肝片组较秋水仙碱组有显著差异(P<0.01)。
       紫七软肝片组有效改善CCl4所致实验性大鼠肝纤维化模型造模过程中肝功能损伤，降低大鼠死亡率，改善CCl4所致实验性大鼠肝纤维化模型肝纤维化指标，以及肝脏组织形态，可以抑制胶原纤维增生，尤其是HA、PcⅢ及Hyp，与病理组织改变表现强弱一致。在与大黄虫丸组的比较中可以看出，紫七软肝片组在肝纤维化发生的初期改善效果较明显，肝纤维化度积分检验与模型组有显著差异P=0.017，可能与肝纤维化早期病机重点为湿热淤毒有关。在肝纤维化后期，两者对肝纤维化的改善相当，即大黄虫丸对肝纤维化后期作用明显，可能与肝纤维化后期病机重点在正虚血淤，有活血化淤散结、缓中补虚功效的大黄虫丸效果较好。紫七软肝片对肝纤维化早期的干预作用明显，优于秋水仙碱;有清化淤毒功效的紫七软肝片对肝纤维化形成的干预作用略优于有活血化淤散结、缓中补虚功效的大黄虫丸。紫七软肝片对肝损伤时胶原生成具有抑制作用，同时对已生成的胶原具有促进降解的作用，因而，可以认为紫七软肝片具有防治肝纤维化的作用，尤其以早期肝纤维化疗效较突出，同时可以推论清化淤毒法对大鼠肝纤维化的干预作用较明显，为抗纤维化治疗提供新思路。
       【参考文献】
         　[1] 周珉,薛博瑜,姜惟.紫七软肝合剂治疗慢性活动性乙型肝炎早期肝硬化120例临床总结[J].南京中医药大学学报,1995,11(2):46.
       
       [2] 韩德五,马学惠,赵元昌.肝硬化动物模型的研究[J].山西医药杂志,1979, 8(4):1.
       
       [3] 色音图,于洪玲,闫国珍,等.复合因子法建立大鼠肝纤维化模型的实验研究[J].中国社区医师,2007,159(9):62.
       
       [4] 沈映君.中药药理学[M].北京:人民卫生出版社,2000:134.
       
       [5] 中华医学会传染病与寄生虫分会，肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华传染病杂志,2001,19:56.