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       【摘要】 
       目的鉴别大叶千斤拔、蔓性千斤拔。方法采用HPLC法，Krosmasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-水梯度洗脱，检测波长为274 nm，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃。结果在选定色谱条件下，建立了稳定可控的高效液相色谱图;应用主成分分析法、系统聚类分析法将药材分成两类，并计算相似度。结论应用高效液相色谱法鉴别大叶千斤拔、蔓性千斤拔是可行的。
       【关键词】  高效液相色谱指纹图谱法; 大叶千斤拔; 蔓性千斤拔; 系统聚类法; 主成分分析
       Abstract：ObjectiveTo identify Moghania macrophylla (Willd.)O.Kuntze and Moghania philippinensis (Merr. et Rolfe)Li. MethodsThe fingerprints were obtained from Waters 2695 instrument; the separation of HPLC fingerprints was performed on a Krosmasil C18 analytical column and gradient-eluted with acetonitrile -water at the flow rate of 1 ml/ min. The temperature of column was 30 ℃. The UV detection wavelength was 274 nm.ResultsPrincipal components analysis and clustering analysis were used in the identification of the samples and the similitude was calculated by computer. ConclusionThe method can identify Moghania macrophylla (Willd.)O.Kuntze and Moghania philippinensis (Merr. et Rolfe)Li..
       Key words： HPLC Fingerprint; Moghania macrophylla (Willd.)O.Kuntze; Moghania philippinensis (Merr. et Rolfe)Li.; Clustering analysis; Principal components analysis
       《中国药典》2005版Ⅰ部中收载千斤拔为豆科植物蔓性千斤拔M.ghania philippinensis(Merr. et Rolfe)Li，大叶千斤拔M.ghania macrophylla(Willd.)O.Kuntze或绣毛千斤拔Moghania ferruginea(Wall.ex Benth.)Li.的干燥根[1] ，为目前市面上治疗效果和销量较好的妇科千金片的君药，具有镇痛、抗炎作用，可治疗妇科病[2]。蔓性千斤拔、大叶千斤拔分布较广，主产于江西、福建、湖北、湖南、广西、广东、四川及中国台湾等省区 [3]。由于千斤拔类药材称谓比较复杂，在药材商品流通和临床使用时很容易混淆，有关大叶千斤拔和蔓性千斤拔的鉴别有报道[3]，但目前未查阅到用高效液相色谱指纹图谱法鉴别该类药材的报道[4～6]。为了更好地指导临床正确、有效和科学地使用该类药材，本实验拟采用高效液相色谱法结合主成分分析法、系统聚类分析法鉴别2005版《中国药典》收载的大叶千斤拔和蔓性千斤拔2种药材，为千斤拔类药材的鉴别提供新方法。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器与试剂Waters2695高效液相色谱仪，Waters2696检测器，Empower Pro色谱工作站，KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，METTLER AE240电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]，乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
       1.2 药品大叶千斤拔、蔓性千斤拔药材均经本校民族药物研究所刘圆副教授鉴定，其来源见表1。表1 药材来源
       1.3 数据处理软件中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版用于对14批样品进行相似度评价， DPS v2.00统计软件用于主成分分析与系统聚类分析。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件与系统适应性色谱柱为Krosmasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱,梯度洗脱程序表见表2，检测波长274 nm;流速1 ml/min，柱温30 ℃;进样量10 μl;所有组分均在110 min内被检测完。
       2.2 样品溶液的制备取以上各样品(过40目筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥型瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，放置12 h，超声处理(功率250 W，频率50 kHz )30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。表2 梯度洗脱程序
       2.3 方法学考察
       2.3.1 运行时间考察了样品2.5 h的色谱记录图，发现110 min后无色谱峰出现，因此确定样品运行时间为110 min。
       2.3.2 精密度、重复性与稳定性取12 号样品粉末(蔓性千斤拔,采于广西恭城)，按上述样品溶液制备方法制备供试液，按上述色谱条件重复进样5次，记录色谱图，以中国药典委员会主持开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版进行相似度评价，结果相似度均大于0.99，说明仪器精密度良好;另取12号样品粉末(蔓性千斤拔,采于广西恭城)5份，分别按上述样品溶液制备方法制备供试液，按上述色谱条件进样，记录色谱图，用相似度评价软件评价相似度，结果相似度均大于0.99，说明方法重复性良好;取12号样品粉末(蔓性千斤拔,采于广西恭城)，按上述样品溶液制备方法制备供试液，分别于0，4，8，16，24，48 h进样，记录色谱图，用相似度评价软件评价相似度，结果相似度均大于0.99，说明样品48 h内稳定。
       2.4 指纹图谱分析
       2.4.1 样品测定取以上各样品粉末,按样品溶液的制备方法制备供试液, 按上述色谱条件进样。色谱图见图1(a)。图1 12批样品与对照品的叠加图(a)和不同波长色谱图(b)比较
       2.4.2 峰信息的提取在选择量化指标(色谱峰数目)时，以“对分类决策有影响的信息应尽量保留，对分类决策无影响的信息应尽量舍弃”的原则筛选了24个色谱峰，以峰面积归一化法计算的每个峰的面积百分比作为HPLC数量化特征。
       2.4.3 相似度评价用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版对12批样品进行相似度评价。结果见表3。
       2.5 主成分分析应用DPS v2.00统计软件对取得的HPLC数量化特征进行主成分分析，前3个主成分的累计贡献率大于80%，主成分分析见图2(a)。
       2.6 系统聚类分析应用DPS v2.00统计软件对取得的HPLC数量化特征以及12批样品的主成分得分进行系统聚类分析(组间距离法,欧氏距离)。结果见图2(b)和2(c)。图2 主成分分析图(a)、聚类分析图(b)和主成分得分的聚类分析图(c)表3 12批样品的相似度计算结果
       3 讨论
       实验曾考察了氯仿、醋酸乙酯、甲醇为提取溶媒进行提取，考察了冷浸提取、超声提取、冷浸后超声提取等方法，最后确定用甲醇冷浸后超声提取30 min效果最好，且方法简便。
       色谱条件的优化 在色谱条件优化过程中，流动相分别比较了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水，最后选择了乙腈-水进行梯度洗脱，因千斤拔组分k"分布区域较广，因此采用曲线梯度洗脱。柱温分别考察了25，30，35 ℃，流速分别考察了0.8，1，1.2 ml/min，最后发现柱温、流速对色谱行为影响不大，综合考虑,最后选择柱温为30 ℃，流速为1 ml/min。选择波长时，参考3D色谱图进行选择，并提取不同波长通道进行比较，最后确定274 nm时色谱图峰较多，丰度较好,不同波长的色谱图比较见图1(b)。比较二者色谱图，直观上很难看出两者的差异，因此必须从量化指标对两者进行进一步比较。从主成分投影图上可看出大叶千斤拔、蔓性千斤拔能较好的分开。
       本研究以24个色谱峰为量化指标进行聚类分析，对每个样品的主成分得分进行聚类分析，结果大叶千斤拔归为一类，蔓性千斤拔归为一类，与预期目标一致。待收集更多千斤拔样品后,作进一步比较，将会获得更多和更为准确的信息。
       待收集更多确定品种和来源的样品后，可建立大叶千斤拔、蔓性千斤拔的判别函数，用以确定未知样品的归属，或建立人工神经网络模型，以更好地区分两种千斤拔，更好的应用于中成药的质量标准控制。本文所建方法简便，灵敏，为两种千斤拔的鉴别提供了新的方法。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：附录22.
       
       [2] 宋立人，洪 恂，丁续亮，等.中国中药学大辞典(上)[M].北京:人民卫生出版社，2001:195.
       
       [3] 饶伟文，黄建楷，温志芳，等.千斤拔的品种调查与质量研究[J].中草药.1999,30(3)：219.
       
       [4] 周 颖，王 彦，王刃锋.半边莲药材HPLC指纹图谱的研究[J].中成药，2007,29(l2):1717.
       
       [5] 王祥培，万德光，裴 瑾，等.头花蓼和头状蓼的HPLC指纹图谱鉴定研究[J].天然产物研究与开发，2007,19:253.
       
       [6] 刘 圆，彭镰心，刘 超，等.木香、川木香、土木香的高效液相色谱指纹图谱鉴别[J].药物分析杂志，2006,26(l1):1574.