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       【摘要】 
       目的设计合成具有NO释放作用的新型异黄酮衍生物，以期通过NO与异黄酮的协同作用，增强衍生物抗肿瘤活性。方法该文将有机硝酸酯通过碳链与异黄酮7-酚羟基连接，得到两个7-取代的异黄酮的硝酸酯衍生物。结果其结构经IR、1H-NMR、13C-NMR和MS 表征，总产率为40%～45%。结论对目标产物进行一氧化氮体外释放测定和体外抗肿瘤活性测试，结果表明产物在2h内释放一氧化氮是单硝酸异山梨醇酯3倍，而且均具有一定的抗肿瘤活性。
       【关键词】  异黄酮; NO供体; 合成; 抗肿瘤活性
       异黄酮是广泛存在于豆类中的植物雌激素，也是多种中草药的有效成分，能够调整人体的内分泌，具有防治妇女更年期综合症[1]，降低血脂，减少冠心病的发生，防治骨质疏松症，抗癌和止痛消肿等活性[2]。研究表明金雀异黄素、染料木素、大豆苷元和鸡豆黄素A 等天然异黄酮具有良好抗肿瘤活性， 并且是一种强力酪氨酸蛋白激酶(PTK)抑制剂，可以抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ活性和抑制肿瘤细胞的DNA合成、抑制肿瘤新生血管生成[3]。NO是体内重要的细胞信使分子和效应分子，参与调节多种生理功能，具有重要的生理和药理作用, 如果体内NO不足可能引发高血压病、动脉粥样硬化、冠心病、急性心肌梗塞、肺肾疾病以及男性性功能异常等疾病[4]。近年来的研究发现，NO在免疫系统中发挥着重要的作用，在免疫细胞、内皮细胞以及其他释放NO的细胞中表现出多方面的抗肿瘤作用，例如抑制肿瘤细胞的增殖[5]，增强巨噬细胞对于肿瘤细胞的毒性，抑制血管生成和转移并加速肿瘤细胞的凋亡，实验证明抗肿瘤药物与NO供体联合用药，其抗肿瘤效果更好[6]，因此，NO供体型药物在肿瘤治疗中受到越来越多的关注。基于以上考虑，本文以7-羟基-4’-甲氧基异黄酮为母体，利用协同前药(mutual prodrug)的设计原理，在7位羟基上连接NO供体片段，合成两个NO供体型异黄酮类衍生物，即7-[(2-硝基氧基)乙氧基]-4’-甲氧基异黄酮(6a)及7-[(3-硝基氧基)丙氧基]-4’-甲氧基异黄酮(6b)，合成路线见图1，初步研究了目标产物体外释放NO体外活性和体外抗肿瘤活性。图1 目标化合物的合成路线
       1 仪器和试剂
       美国Perkin公司傅立叶变换红外光谱仪，瑞士Bruck公司超导核磁共振仪，日本Shimadzu公司质谱分析仪，德国Heraeus公司恒温CO2培养箱：美国BIO-RAD公司酶联免疫检测仪，日本Olympus公司倒置显微镜。所用试剂均为市售化学纯，必要时经无水处理。
       2 方法
       2.1 7-羟基-4’-甲氧基异黄酮(4)的合成将间苯二酚22g(0.20 mol)和对甲氧基苯乙酸32.8 g(0.20 mol)置于三颈瓶中，用70 ml BF3·Et2O中，恒温80℃下电磁搅拌反应6h，生成脱氧安息香(TLC跟踪反应进程)。冷却至10℃，加入DMF(300ml)和BF3·Et2O(100 ml)，升温至50℃，滴加干燥的甲基磺酰氯(70 ml)和DMF(100 ml)混合液，升温至78℃反应3 h，将冷却物倒入大量碎冰中，有大量棕红色固体沉淀，过滤收集固体，真空干燥后，得到浅红色粉末42.2 g，收率为78.7%，m.p. 257.0～258.3 ℃。
       2.2 7-溴乙氧基-4’-甲氧基异黄酮(5a)的合成 将无水 K2CO3 5.6 g和17 ml(0.20 mol) 二溴乙烷置于三颈瓶中，加少量的KI，7-羟基-4’-甲氧基异黄酮5.5 g(0.02 mol)溶解于50ml的DMF与50 ml的丙酮组成的混合液中，在搅拌下缓慢滴进三颈瓶中。恒温60℃下电磁搅拌反应24 h(TLC跟踪反应进程)。反应完成后，冷却至室温，减压过滤，真空干燥得浅黄色固体6.6g， 收率为68.3%，m.p. 180.5～180.6℃; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)δ : 3.72 (2H, t, -CH2Br), 3.87 (3H, s, -OCH3), 4.41 (2H, t, -OCH2- ), 6.88-8.26 (8H, -Ar); 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 28.4, 55.4, 68.2, 101.1, 114.0, 114.6, 118.9, 124.1, 124.9, 128.1, 130.1, 152.1, 157.8, 159.6, 162.3, 175.8。
       2.3 7-溴丙氧基 -4’-甲氧基异黄酮(5b)的合成称取7-羟基-4’-甲氧基异黄酮5.5g(0.02 mol)溶解于50 mlDMF与50 ml丙酮的混合液，在搅拌下缓慢滴进盛有无水 K2CO3 5.6 g ，1,3-二溴丙烷20.2 ml(0.20 mol) 和少量碘化钾的三颈瓶中。加热恒温60℃下电磁搅拌反应20 h(TLC跟踪反应进程)。反应完成后，冷却至室温，减压过滤，真空干燥得浅黄色固体7.9 g, 收率为74.5%, m.p.248.5～249.1℃; 1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) δ : 2.40 (2H , t ,-CH2-CH2-CH2) , 3.65 ( 2H, t , -O-CH2-) , 3.86 ( 3H , s , -O-CH3 ),4.23 (2H , t , -CH2-Br), 6.88-8.24 (8H , m , Ar). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)δ: 29.6, 32.0, 55.4, 66.0, 100.8,114.0, 114.7, 118.6, 124.2, 124.9, 127.9, 130.1, 152.1, 157.9, 159.6, 163.0,175.8。
       2.4 7-[(2-硝基氧基)乙氧基]-4’-甲氧基异黄酮(6a)的合成[7]将硝酸银6.0g(0.035 mol)溶于无水乙腈20 ml中，搅拌下避光加热至50℃，迅速加入7-溴乙氧基-4’-甲氧基异黄酮2.4 g(0.006 4 mol)和无水乙腈55 ml的混合液。加毕继续加热至70℃，反应3h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入醋酸乙酯和水，分出有机层，用醋酸乙酯(20 ml×3)萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却并凉干，得到白色结晶3.8g, 收率为73.3% ，m.p. 139.8～141.7℃; IR (KBr) υ: 3 445,2 927, 1 633, 1 517, 1 446, 1 297, 1 259, 1 025, 828; 1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) δ: 3.86 (3H , s , -O-CH3 ), 4.36(2H , t , -CH2-ONO2), 4.89(2H , t , -O-CH2-), 6.86-8.25(8H, m, Ar); 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 28.3, 55.4, 64.5, 68.8, 70.4, 101.1, 114.0, 114.4, 114.6,119.1, 124.1, 125.0, 128.1, 128.2, 130.1, 152.1, 157.7,159.7, 162.1, 157.7;159.7, 162.1, 175.7 ; MS m/z+ 357.9。
       2.5 7-[(3-硝基氧基)丙氧基]-4’-甲氧基异黄酮(6b)的合成将硝酸银6.0 g(0.035 mol)溶于无水乙腈20 ml中，磁力搅拌，避光加热至50℃，迅速加入7-溴丙氧基-4’-甲氧基异黄酮2.4 g(0.006 2 mol)和无水乙腈55ml的混合液。加毕继续加热至70℃，反应2.5 h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入醋酸乙酯和水，分出有机层，用醋酸乙酯(20ml×3)萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却，得到白色结晶4.7 g, 收率为76.6%，m.p.121.2～121.5℃; IR (KBr) υ: 3 451, 2 926, 1 627, 1 514, 1 444, 1 279, 1 259, 1 180, 1 034, 888, 829; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz))δ: 2.31 (2H, t, -CH2-CH2-CH2), 3.87 (3H, s, -O-CH3), 4.12 (2H , t , -CH2-ONO2), 4.73 (2H , t , -O-CH2-), 6.87～8.25 (8H, m, Ar). 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)δ: 26.9， 29.7, 55.4, 64.2, 69.6, 100.8,114.0, 114.6, 118.8, 124.2, 125.0, 128.0, 130.1, 152.1, 157.8, 159.6, 162.7, 175.8; MS m/z+ 371.9。
       3 初步活性实验[8，9]
       3.1 目标化合物NO 释放量的测定将目标产物及对照化合物单硝酸异山梨醇酯溶于二甲基亚砜中(0.01 mol/ L) ,再用磷酸缓冲液稀释。缓冲液里含有过量的半胱氨酸(5 mmol/ L) ,混匀,受试物终浓度为10- 4 mol/ L 。将溶液置于37 ℃环境中孵化, 于不同时间点取反应液8 ml与格里斯试剂2 ml混合在锥形瓶中，试剂混合,室温放置10 min ,于540 nm 处测吸收度。NO 释放量以其氧化物亚硝酸盐(NO2-)的量表示。结果如图2所示，合成的两个一氧化氮供体化合物在2 h内，释放一氧化氮明显，均达到40%Cmax以上水平，高于单硝酸异山梨醇酯的一氧化氮释放量3倍左右;2 h后，释放趋于平缓。单硝酸异山梨醇酯的一氧化氮释放量低，具有释放缓慢增多的趋势。在3 h内，6a、6b和单硝酸异山梨醇酯的Cmax分别为0.25、0.195、0.122。这3个化合物的NO释放量顺序是6a >6b >>单硝酸异山梨醇酯。图2 NO的体外释放
       3.2 体外抗肿瘤活性实验用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将人淋巴样白血病细胞HL-60稀释成5 × 104个/ml的细胞悬液，取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置于恒温CO2培养箱中培养24 h。然后分别加入化合物4、6a和6b20 μl/孔，每档浓度设4 个平行孔，另设溶剂对照组, 培养48 h。加入MTT，再培养4 h后吸去上清液，各孔加150 μl DMSO，轻轻振荡5 min后用酶联免疫检测仪在标波长为490 nm处测定各孔的吸光度( A) 值，并计算细胞的抑制率。从图3可以看出，化合物4、6a和6b在10～100 μg/ml的浓度下，三者均表现出了抑制人淋巴样白血病细胞HL-60增殖的作用，而且这种作用呈剂量依赖性，同时还可以看出，异黄酮与一氧化氮供体偶联物6a和6b的细胞抑制率与母体异黄酮4相比有了明显的提高，可能是因为6a和6b释放出NO与母体产生协同作用，增强了抑制肿瘤细胞增殖活性。图3 目标产物对HL-60细胞的抑制作用
       4 讨论
       由7-羟基-4’-甲氧基异黄酮4制备5a和5b的反应是属于分子亲核取代反应加入少量的KI作为催化剂加快反应速率，因为I-既是强的亲核试剂又是很好的离去基团，先利用它取代二溴乙烷或二溴丙烷中的一个溴形成1-溴-2-碘乙烷或1-溴-3-碘丙烷，然后7-OH容易取代取代1-溴-2-碘乙烷或1-溴-3-碘丙烷中的碘生成5a或5b。同时加入的无水碳酸钾作为缚酸剂，可以及时除去生成的酸性物质。利用5a和5b与硝酸银避光下合成NO供体型异黄酮类衍生物，主要目的是为了防止硝酸银见光分解使得副产物增加。谱图分析：5a和5b的1H NMR谱大部分相差不大，只是5b比5a在化学位移2.4处多两个氢，这是5b比5a多一个亚甲基缘故。6a与5a 相比，由于硝基氧基取代了溴，导致原来与溴相连的亚甲基上的氢向低场移动，化学位移从3.72 ppm增为4.12 ppm，同样6a和6b的氢谱也有类似的变化。目标产物的红外光谱中，在1 650cm-1附近都有羰基特征峰。初步研究表明，调节连接碳链的长度，能够控制NO的释放速率，将具有释放一氧化氮活性的硝酸酯与异黄酮偶联，在一定程度上提高了抑制人淋巴样白血病细胞HL- 60增殖活性，可能是因为NO供体新异黄酮在人淋巴样白血病细胞HL-60内释放出异黄酮和NO，两者产生协同效应，导致了抗肿瘤作用增强。
       【参考文献】
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