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       【摘要】 
       目的研究电针和针药结合治疗抑郁症作用的机理，通过两者基因谱表达的异同以了解针药结合的优缺点，为临床应用电针和针药结合治疗抑郁症提供实验依据。方法取正常组、模型组、电针组、针药组(电针合并氟西汀灌胃)大鼠的海马组织进行RocheNimbleGen全基因组表达谱芯片测试并进行数据分析。结果电针组“纠偏”的基因有226条;针药组“纠偏”的基因有221条，“增偏”的基因(与正常组的差异更甚于模型组)有9条。两组“纠偏”的基因均以下调的基因为主，涉及凝血、炎症和凋亡相关基因等，其中电针组为125条，针药组为157条;而上调的基因包括蛋白质生物合成有关的基因、嗅觉感受器和微管系统基因等，其中电针组为101条，针药组为64条。结论电针与针药治疗抑郁症的机理与改善多条基因的表达有关，两者的差异表达基因谱较为相似;针药结合的优势体现在强有效地下调凝血因子Ⅴ和5羟色胺2C受体的表达。同时针药结合的结果还出现“增偏”基因，可能是由于氟西汀的副作用引起的。
       【关键词】  电针; 针药结合; 抑郁症; 基因芯片
       近十年来，有大量报道运用电针或电针合并氟西汀治疗抑郁症的临床及实验研究。通过临床观察对比，电针或针药结合比口服氟西汀起效快，电针在快速起效中起了主要作用;而针药结合又能减轻氟西汀的不良反应，较氟西汀、单纯电针疗效更确切，可缩短病程，是一种安全、有前途的联合治疗方法[1]。但在动物实验研究[2～4]中并未反映针药结合比单纯电针具有更好的疗效，或者针药结合比单纯电针具有更多不良反应。为了深入了解针药结合的优势及其不足之处，我们对运用电针和电针合并氟西汀治疗的抑郁症大鼠进行全基因组表达谱芯片测试并进行数据分析，寻找两者基因谱表达的异同，以了解针药结合的优缺点;亦从基因表达的层次讨论两者治疗抑郁症的机理。
       1 材料与仪器
       1.1 动物SD清洁级大鼠，体质量220～260 g，雄性，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙)20080033。
       1.2 仪器和试剂Morris迷宫(淮北正华生物仪器设备有限公司产品，型号:MORRIS); HANS200B型韩氏穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司生产);Nanodrop ND1000微量紫外/可见分光光度计(美国NanoDrop科技有限责任公司);MAUI Hybridization System生物芯片杂交仪(美国BioMicro Systems);Genepix4000B Scanner芯片扫描仪(美国Axon公司)。Trizol (美国invitrogen公司)，RNeasy kit(RNA提取试剂盒) (德国Qiagen公司);Cy3(吲哚类菁染料)等。
       2 方法
       2.1 分组大鼠经适应性饲养1周后用OpenField法作行为学测试。实验中所用“敞箱”以morris迷宫代之。用该系统记录大鼠在3 min内的水平活动轨迹并计算相应的路程，以反映大鼠的活跃程度或抑郁状态，比通常所用敞箱数方格的方法准确。为了尽可能降低实验数据的离散度，经反复实验，选取水平路程在(2 700～3 500 cm)的正常大鼠进行实验。另以大鼠两只前肢离地直立次数为垂直活动得分，以反映其对外界的好奇心和探究心理。由于直立次数在个体间的差异较小，一般按水平路程的测试结果进行评价。将水平路程相近的40只大鼠随机分为正常组、模型组、电针组、针药组，共4组，每组10只;正常组每笼饲养5只，其余各组每笼1只(置小笼中孤养)。
       2.2 造模模型组、电针组、针药组大鼠，共接受21 d各种不同的应激，包括冰水游泳(4℃，5min)、热应激(45℃水浴，5 min)、禁水(24 h)、夹尾(1 min)、电击足底(电压50 mV，每隔15 s刺激1次每次持续10 s，共15次)、摇晃(1次/s，5 min)、禁食(24 h)和昼夜颠倒等刺激，每天随机给予1～2个刺激，相同的刺激不连续出现，每种刺激总共不少于4次。正常组大鼠不接受应激，并饲养在另一间房间以免受影响。
       2.3 治疗(造模结束行为学测试后立即介入治疗)正常组：继续常规饲养，每笼饲养5只;模型组：继续孤养，不予任何治疗措施;电针组：继续孤养，电针治疗。治疗时操作者采取坐姿，弯膝，两腿间铺以隔水的塑胶，取一废枕头套置其上，大鼠自笼中取出后令其趁势钻进枕头套中，遮蔽其双眼并用手固定其头部。选择百会、印堂穴：根据《实验针灸学》[5]大鼠穴位图谱选百会穴，并依据比较解剖学，在大鼠前正中线与额顶骨缝交界线前方处定印堂穴。选用苏州医疗用品厂生产的“华佗”牌0.35×13 mm针刺针进行治疗。针刺方法：百会穴、印堂穴均向前(鼻侧)平刺4 mm，分别接韩氏穴位神经刺激仪的正负极，频率2Hz，输出电流1 mA，刺激时程15 min/次，1次/d。在施针过程中保持安静，避免惊吓大鼠，减少额外刺激。针药组：按照1.8 mg·kg1给予氟西汀灌胃后30 min施以电针。由于大鼠的生活规律为昼伏夜出，为了不干扰其白天休息，特意在20：00～24：00进行治疗。分别于造模前(d0)、造模结束(d21)及治疗一周后(d28)测定各组大鼠的体质量、行为学(水平运动和垂直运动)和糖水消耗量。
       2.4 取材治疗1周后处死各组大鼠，开颅取脑，在冰盒上分离海马，置液氮中保存。正常组、模型组、电针组、针药组大鼠各取1个标本送交上海康成生物工程有限公司进行RocheNimbleGen全基因组表达谱芯片测试以及real timePCR验证，芯片名称为Rattus norvegicus 12×135Karray。
       2.5 全基因组表达谱芯片主要实验流程
       2.5.1 总RNA的抽提及质量检测取正常组、模型组、电针组、针药组大鼠海马组织各100 mg，用Trizol和RNeasy kit抽提RNA，使用Nanodrop测定RNA在260 nm、280 nm和230 nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
       2.5.2 cDNA样品合成和标记取1μg总RNA，反转录成cDNA并用Cy3标记。
       2.5.3 标记效率质量检测使用Nanodrop检测荧光标记效率，保证后续实验的可靠性。
       2.5.4 芯片杂交在标准条件下将标记好的探针和高密度基因组芯片在杂交盒中65℃滚动杂交17 h，依次用相应的洗涤液洗涤芯片，室温晾干。
       2.5.5 图象扫描及数据处理用Genepix4000B Scanner扫描芯片，以NimbleScan software (version 2.5，Roche )读取原始数据(raw intensity)，并进行背景值修正和分位数标准化处理 (Normalized )，将标准化后的数据导入Genespring GX (Agilent version 10.0)，比较两组样品之间Normalized值，计算Fold change。
       2.6 判定标准fold change≥2的基因为表达显著上调基因，Fold change≤0.5为表达显著下调基因。
       3 结果
       (由于篇幅所限，本文未列出大鼠体重、行为学和糖水消耗量的数据，电针组和针药组对上述指标均有改善趋势)。
       3.1 散点图所有基因在两组样品中的表达差异可用散点图表示。其中X轴和Y轴分别以2个样品的荧光信号强度值为坐标，图中每一个数据点代表芯片上一个基因的杂交信号，绝大多数无差异表达信号位于3条平行线之间，差异表达信号为平行线之外的数据点。左图中平行线以外左侧数据点为模型组VS正常组上调表达的基因，右侧数据点为模型组VS正常组下调表达的基因;中图中平行线以外左侧数据点为电针组VS模型组上调表达的基因，右侧数据点为电针组VS模型组下调表达的基因;右图中平行线以外左侧数据点为针药组VS模型组上调表达的基因，右侧数据点为针药组VS模型组下调表达的基因。　　chip2为正常组，model1，为模型组，chip7为电针组，chip9为针药组图1 散点图
       3.2 聚类图聚类图是按照层次聚类(hierarchical)的分析方法，根据样本表达谱的相似性将样本划分为不同的组别，以反映各组基因表达的亲远关系。从图2可知，正常组和模型组分据两端，关系最远;电针组和针药组居于中间，其中电针组距离正常组更近些，表明电针组基因谱的表达与正常组更为相似。chip2为正常组，model1为模型组，chip7为电针组，chip9为针药组。采用Chip2 vs Model1，Chip7 vs Model1和Chip9 vs Model1差异基因的交集对Chip2，Chip7，Chip9及Model1四个样本作聚类图2 聚类图
       3.3 差异表达基因谱根据基因芯片的荧光强度而获得的差异表达基因，是分别将模型组VS正常组、电针组VS模型组、针药组VS模型组进行比较的结果。其中模型组VS正常组的差异表达基因668条，下调267条，上调401条;电针组VS模型组的差异表达基因1482条，下调416条，上调1 066条;针药组VS模型组的差异表达基因1 276条，下调444条，上调832条。我们所考虑的是电针及针药结合疗法通过调控哪些基因以治疗抑郁症，所寻找的是能反映疾病本质的基因，而电针组VS模型组及针药组VS模型组的差异表达基因过于宽泛，必须将两者与模型组VS正常组的差异表达基因进行比较，才能找出真正的目标基因。通过上述比较，我们得到两个交集：(电针组VS模型组)VS(模型组VS正常组)226条基因;(针药组VS模型组)VS(模型组VS正常组)230条基因。这两个交集中又因上调下调的不同而各自分出两个子集。前者226条基因中，模型组VS正常组表达下调的基因，恰恰是电针组VS模型组表达上调的基因;而模型组VS正常组表达上调的基因正好是电针组VS模型组表达下调的基因。换言之，电针组纠正因造模导致的基因表达的偏差(当然，是部分纠正)。后者230条基因中绝大部分与电针组类似，为“纠偏”的基因，但也有个别基因是“增偏”的，即上调、下调的趋势与模型组相同，而且信号比值(fold，change)大于模型组，其与正常组的差异更甚于模型组。以下表1～2为上述电针组和针药组“纠偏”的基因，并对其进行功能分类。
       3.3.1 抑郁症模型大鼠下调表达的，经电针及针药治疗后表达趋于正常的基因见表1。
       3.3.2 抑郁症模型大鼠上调表达的，经电针及针药治疗后表达趋于正常的基因见表2。表1 抑郁症模型大鼠下调表达的，经电针及针药治疗后表达趋于正常的基因表2 抑郁症模型大鼠上调表达的，经电针及针药治疗后表达趋于正常的基因
       3.3.3 小结针药组与抑郁症治疗相关的差异表达基因谱类似于电针组，亦有差异。电针组“纠偏”的基因有226条;针药组“纠偏”的基因有221条，“增偏”的基因有9条。两组“纠偏”的基因均以下调的基因为主，可以分为凝血、免疫、炎症、凋亡、信号转导、蛋白质降解等几个类别，电针组有125条，针药组有157条。其中，对于信号转导、运动、摄食和睡眠等功能的调节，针药组优于电针组，而对于凋亡的调节，电针组则优于针药组。而上调的基因中，可以分为能量和物质代谢、蛋白质生物合成、嗅觉感受器、微管系统、转录调节等几个类别，电针组有101条，针药组有64条。其中，对于能量代谢、蛋白质生物合成、抗氧化应激损伤等基因的调节，电针组优于针药组。此外，针药组出现某些“增偏”的基因，电针组则未出现。
       4 讨论
       4.1 电针组与针药组“纠偏”基因的生物学功能
       4.1.1 抑郁症模型大鼠下调表达的，经治疗后表达增高的基因(只讨论其中一部分)与蛋白质生物合成有关的基因(如ribosomal protein)：核糖体蛋白(ribosomal protein)是核糖体的重要组成部分，在蛋白质合成过程中起重要的作用，例如对核糖体的空间构象进行调整，形成有功能的三维结构;在核糖体的结合位点上协同rRNA催化蛋白质的合成，等等。核糖体蛋白基因在抑郁模型大鼠脑中表达下降，意味着蛋白质生物合成可能出现障碍，继而将导致相应的生物学功能的降低，出现抑郁症状;而经电针及针药治疗后这类基因表达增加，有利于蛋白质生物合成的顺利进行，调节相应的生物学功能，减轻抑郁症状。
       嗅觉感受器基因(olfactory receptor)：大脑负责嗅觉和情绪的区域杏仁外侧核、边缘系统甚至下丘脑等有重叠和交叉，其功能相互联系和相互影响。临床发现，重度抑郁症患者可能损害嗅觉功能，其嗅觉敏感度低于正常人[6]。嗅觉系统的感受器一旦破坏，嗅觉传入通路中断，嗅觉中枢兴奋来源丧失，脑中枢反馈通路中断，神经递质紊乱，而引起抑郁症。同时，嗅觉感受器损伤导致多巴胺受体感觉神经元缺失，使嗅球区多巴胺分泌减少，也是导致抑郁症的可能因素[7]。抑郁模型大鼠脑中嗅觉感受器基因的表达普遍下降，是其抑郁症状的反映;经电针及针药治疗后此类基因表达趋于正常，正是其疗效的体现。
       与能量代谢有关的基因(cytochrome c oxidase subunit VIc1，细胞色素c氧化酶VIc亚基)：为电针组所独有。细胞色素c氧化酶在细胞呼吸中处于细胞色素系统的末端，接受来自4个细胞色素c的4个电子，并传递到一个氧气分子上，结合来自基质内的4个质子来制造水分子，同时跨膜转运4个质子，形成跨膜的质子电化学势能差，该势能差可用于制造ATP。细胞色素氧化酶是由多个亚基和辅因子组成的，必须要通过组装才能形成完整的活性分子。细胞色素氧化酶亚基在抑郁模型大鼠脑中表达下降，表明其能量代谢受抑制，ATP生成减少;而大鼠经电针治疗后该基因表达增加，从而增加ATP的生成，有利于细胞功能的发挥。
       4.1.2 抑郁症模型大鼠上调表达的，经治疗后表达降低的基因(只讨论其中一部分)
       与凝血相关的基因：凝血因子Ⅴ基因在抑郁症模型大鼠的表达比正常组增加了23.4倍，显示该基因在抑郁症发生发展过程中意义不同寻常。活化的凝血因子Ⅴ(FⅤa)的作用为FVa、FXa、钙离子及磷脂(细胞膜)共同构成凝血酶原复合物，参与凝血酶原的活化，显著提高凝血酶原的活化速率[8～10]。凝血因子Ⅴ急剧增多其后果可能导致血液凝固性增加而使血流缓慢，局部脑血流灌注降低。
       与模型组比较，电针组的凝血因子Ⅴ下调了2.1倍，而针药组下调了25倍，远低于电针组，甚至低于正常组(但与正常组无显著性差异)。提示电针和针药对于大脑均有活血通络作用，帮助机体恢复正常的新陈代谢，以减轻抑郁症状;而针药的作用远远强于单纯电针，可能是电针与药物(氟西汀)协同作用的结果。
       与炎症相关的基因(如phospholipase A2， group V，sPLA2V，磷脂酶A2 V亚基)：sPLA2V为针药组独有，属分泌型磷脂酶A2，集中分布于大脑皮层和海马[11，12]，在急、慢性炎症反应中，PLA2活性均增高并介导一系列病理生理过程，在许多炎症介质和细胞因子的表达激活的网络调节中起着“扳机样”作用。sPLA2V能促进白细胞三烯C4和前列腺素E2的生成 [13]，在急性炎症反应中，sPLA2V在调控类花生四烯酸物质反应中对免疫系统也产生调控作用[14]。
       sPLA2V的表达显著增加，表明抑郁症模型大鼠的炎症反应加剧，将导致一些细胞结构损伤和功能下降;经针药治疗后基因表达趋于正常，在一定程度上减轻免疫和炎症反应，对抑郁症状的缓解不无益处。另外，电针组下调Toll样受体(TLR)3，从另一方面改善抑郁症模型大鼠的免疫和炎症反应，则是电针组所特有的。
       与凋亡相关的基因(如Death receptor 5，死亡受体5)：死亡受体5 (DR5)，是在TRAIL(肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体)诱导细胞凋亡过程中起主要作用的受体，具有胞浆死亡结构域，与TRAIL特异性结合后可通过死亡结构域激发和传递死亡信号，激活caspase蛋白酶解级联反应，导致细胞死亡。除了引起肿瘤细胞凋亡以外，也和胸腺细胞和神经细胞的死亡有关[15，16]。
       有报道凋亡参与应激导致神经元损伤。Lucassen发现重症抑郁患者在视皮质、海马下脚、齿状回及CA1、CA4区有神经细胞的凋亡 [17]，以及慢性心理应激大鼠海马神经元减少[18]。DR5等基因在抑郁症模型大鼠海马中表达增加，加剧细胞凋亡。电针组和针药组均下调DR5的表达，这对于神经细胞存活和维持相应的生理功能具有重要的意义。与减少运动和摄食有关的基因(5hydroxytryptamine receptor 2C，5羟色胺2C受体)为针药组独有。5羟色胺2C受体是5羟色胺受体家族中的一个亚型，属G蛋白偶联受体，具有减少运动和摄食的功能[19]。研究表明，主要情感失常性疾病的发病机制与2C受体的基因多态性有一定的关联[20]。激活下丘脑和边缘叶结构的5羟色胺2C受体将导致欲望和觉醒的降低[21，22]。在抑郁症模型中，孤养将导致5HT2c受体的敏感性增强，而后者在动物焦虑症/抑郁症模型中可能促进动物对应激的反应以及对新事物的恐惧[23]。精神病患者和正常人服用5HT2C受体激动剂mchlorophenylpiperazine (mCPP)后兴奋5HT2C受体，表现出一系列焦虑症状[24];而5羟色胺2C受体的抑制剂S32006对多种抑郁模型均显示良好的抗抑郁和抗焦虑作用[25]。深入的研究表明：5羟色胺2C受体可以促进GABA的释放，而后者可通过GABA A和B受体抑制5HT的释放[26～31]。以上研究有力地证明了5羟色胺2C受体与抑郁症发生的密切关系。
       单纯电针组对5羟色胺2C受体的表达下调倍数为1.524，无显著性差异，而针药组为2.63，明显下调其表达，使运动和摄食增加，这是针药结合治疗抑郁症的优势的体现，是针药协同作用的结果。
       4.2 针药组“增偏”基因的生物学功能lipopolysaccharidebinding protein (LBP，脂多糖结合蛋白)等9条基因上调、下调的趋势与模型组相同，且与正常组的差异更甚于模型组。上调的基因大多与免疫、炎症有关，下调的只有NADHubiquinone oxidoreductase B9 subunit (Complex IB9) (CIB9)，为NADH呼吸链组分。LBP属于I型急性期反应蛋白，对LPS(脂多糖)中的类脂A具有高度亲和性，LBP的N端可以与LPS结合，其C端可以与CD14结合，是LPS发挥生物学作用的重要载体，可增强细胞对低浓度LPS的反应性及炎症介质的生成[32，33]。这些上调基因似乎与表2所显示的那样——针药组下调与免疫、炎症相关基因的表达——相矛盾。这充分体现了针药结合治疗抑郁症其调控机制的复杂性。由于蛋白质是生物功能的直接体现者，在基因的转录过程、基因→蛋白质的翻译水平以及蛋白质的修饰过程都可能被外来因素所干预，最后的疗效是干预因素共同作用的结果，单纯考虑基因的表达并不足以反映全过程。
       “增偏”基因的出现，表明针药结合治疗抑郁症并非完美无缺，在获得确切疗效的同时，还会出现某些不利于机体的反应。由于单纯电针并未出现“增偏”基因，推测是由于氟西汀的副作用引起的。
       4.3 小结由上述讨论可知，电针与针药治疗抑郁症的机理均涉及凝血、炎症和凋亡相关基因的下调表达，以及与蛋白质生物合成有关的基因、嗅觉感受器等基因的上调表达。此外，电针还能改善与能量代谢有关的基因的表达，而针药结合的优势体现在强有效地下调凝血因子Ⅴ和5羟色胺2C受体的表达。同时针药结合的结果还出现“增偏”基因，可能是由于氟西汀的副作用引起的，同时可能也是上述聚类图中针药组与正常组距离更远的原因。本实验是电针与针药治疗抑郁症大鼠一周时测定的结果，由于氟西汀起效缓慢，因而该结果亦为电针和针药结合治疗抑郁症快速起效提供了较充分的实验依据。
       本实验不足之处是：限于研究经费，每组大鼠只取一个标本作基因芯片测试，将增加实验误差，影响差异表达基因的筛选，要同时进行其他实验加以佐证。我们还对其中的6条基因进行realtime PCR验证，与芯片测试的结果基本相符，表明本次基因芯片测试的数据是可信的。限于篇幅，本文未将PCR验证的结果列出。
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