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       【摘要】 
       目的探讨急性脑梗塞患者血清MMP-9及TIMP-1变化与血瘀证的相关性。方法对136例脑梗塞患者进行中医证候要素评分及血清MMP-9及TIMP-1测定。结果血清MMP-9比较，血淤证组较非血淤证组显著升高（P <0.01），在脑梗塞急性期的4个时点中，血淤证患者血清MMP-9在前3 d呈升高趋势，在72h以后开始下降；血清TIMP-1比较，血淤证组与非血淤证组均无显著差异（P >0.05）。血瘀证与血清MMP-9显著相关（P <0.01），与血清TIMP-1无明显相关（P >0.05）。结论血清MMP-9与血淤证呈正相关，在脑梗塞急性期前3 d呈升高趋势，72 h后下降，随着血清MMP-9升高，血淤证的程度加重，但血淤证与血清TIMP-1无明显相关。
       【关键词】  脑梗塞； 血淤证; 基质金属蛋白激酶-9; 基质金属蛋白酶组织抑制剂-1
       Relationship between the Changes of MMP-9、TIMP-1 Contents  and Blood Stasis Syndrome in Patients with Acute Cerebral Infarction
       LI Linsen1,,TIAN Jinzhou,CAI Yiling,SHI Jing,XING Yanan,SUN Wenjun
       1.Insititute of China Minority Traditional Medicine, Central Nationality University,Beijing,100081,China；2.Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing100700,China；3. 306th Hospital of PLA,100101,China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between blood stasis syndrome (BSS) defined by traditional Chinese medicine in cerebral infarction and the contents of MMP-9 and TIMP-1.MethodsAll subjects comprised 128 patients with acute ischemis stroke, which were based on diagnostic criteria for cerebral Vascular diseases in 2005.Diagnosis for syndromes defined by traditional Chinese medicine were made according to Diagnostic Criteria for Stroke in 1994.ELISA was adopted to detect the contents of MMP-9 and TIMP-1 in serum.ResultsThe level of MMP-9 in serum of patients with CI and BSS was much higher than that in  patients without BSS but with CI(P<0.01). The content of MMP-9 in BSS patients with BSS and CI was increased in the first three days,but the content of MMP-9 in these patients was decreased thereafter. The content of TIMP-1 had no difference between patients with BSS and CI and those patients without BSS but with  CI（P >0.05）. There was significant correlation between MMP-9 and BSS in patients with cerebral infarction (P<0.01).There was no correlation between TIMP-1 and BSS in patients with cerebral infarction（P>0.05）.ConclusionThere is significant correlation between MMP-9 and BSS in patients with cerebral infarction.The content of MMP-9 in BSS patients with BSS and CI present will increase in the first three days,but the content of MMP-9 in these patients will decrease thereafter. The severity of BSS in patients is enhanced with the increase of MMP-9.There is no correlation between TIMP-1 and BSS in patients with cerebral infarction.
       Key words：Cerebral infarction;   Blood stasis syndrome;   MMP-9;   TIMP-1
       
       近年来，血淤证（blood stasis syndrome，BSS）的生物学基础研究进行了许多有益的尝试，取得了一定的进展，但其证候实质仍未弄清。随着血淤证的客观化研究不断深入，许多研究发现血淤证是一种病理生理学的诊断，各种致病因子所造成的全身或局部组织器官的损伤应激、血循环障碍等导致各组织器官水肿、炎症渗出、血栓形成是血淤证一系列的病理变化［1］。课题组前期研究发现血淤证的发生与颈动脉粥样硬化（Carotid atherosclerosis，CA）有密切的关系，且血瘀证与颈动脉粥样硬化斑块形态及数目存在正相关，在发生脑梗塞时，血淤证的斑块数目增加，不稳定性增高［2］。尽管我们的研究发现了血淤证与颈动脉粥样硬化的宏观关系，但其内在的微观联系尚不清楚，仍有待于进一步探讨。
       
       研究发现基质金属蛋白激酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是明胶酶的一种，它通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖凋亡及细胞外基质的重塑在动脉粥样硬化斑块的形成、发展及破裂中发挥了重要作用［3］。基质金属蛋白酶组织抑制剂－1（tissues inhibitors of metalloproeinases-1,TIMP-1）是组织中MMP 主要的内源性抑制因子，在不稳定粥样斑块中常见到巨噬细胞增多，MMP-9分泌增加，使基质降解增强，TIMP-1对有MMP-9产生的基质降解起着很重要的平衡作用，纤维帽的胶原分解与否取决于MMP-9与TIMP-1之间衡状态［4］。因此测定脑梗塞患者血清MMP-9及TIMP-1指标的含量，可以作为CA及不稳定斑块的血清学参考指标之一。本研究拟探讨血淤证与脑梗塞患者血清MMP-9及TIMP-1的相关性，从细胞因子的层面进一步探讨血淤证与CA的相关性。
       1   一般资料
       1.1  诊断标准 
       西医诊断标准依据1995年第4届全国脑血管病学术会议制定的《各类脑血管病诊断要点》［5］，中医诊断标准依据国家中医药管理局全国脑病急症科研协作组制定的《中风病诊断疗效评定标准》［6］及《中风病辨证诊断标准》［7］。血淤证证候要素评分≥7分时证候诊断成立。
       1.2  纳入及排除标准
       脑梗塞纳入标准：①符合动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、腔隙性梗塞的诊断，并具有神经功能缺损的临床表现者；②符合中医中风病诊断；③年龄≥40岁，≤80岁；④发病1周以内的患者。排除标准：①短暂性脑缺血发作(TIA)；②脑出血；③发病超过1周；④经检查证实由脑肿瘤、脑外伤、血液病等引起的卒中患者，因风湿性心脏病、冠心病及其他心脏病合并房颤，引起脑栓塞者；⑤合并有肝、肾、造血系统、内分泌系统等严重疾病及骨关节病、精神病者。
       1.3  临床资料   
       2006-12～2008-01期间，来源于中国人民解放军第306医院（以下简称306医院）的脑梗塞患者140例，其中资料不全1例，死亡2例、不符合纳入标准1例，最终136例完成本研究。其中男性80例，女性56例，年龄为（64.90±10.22）岁，最大年龄80岁，最小40岁，其中40～50岁14例，51～70岁73例，71～80岁49例。血淤证组66例，非血淤证组70例。全部病例在平均年龄(t检验)、年龄分布(χ2检验)、性别比(χ2检验)上均无显著差异(P>0.05)，从基线分析结果看，本研究的观察对象具有可比性。
       2  方法
       2.1  分组按疾病证候诊断将脑梗塞患者分为血淤证组及非血瘀证组。
       2.2  血清MMP-9及TIMP-1测定 入院第2天上午五点到七点间抽取脑梗塞患者肘静脉血6 ml，用促凝管收集、立即离心超净工作台分离血清，-80℃冰箱保存。所有过程均严格执行无菌操作，患者采血前均无感染及应用免疫佐剂或免疫抑制剂，所有血清标本统一存放。用酶免疫吸附（ELISA）双夹心抗体法，统一检测样本MMP－9及TIMP－1的含量。实验所用试剂盒购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司，实验在北京中医药大学东直门医院药理实验室完成，所有操作均严格按说明书要求进行。
       2.3  中医证候要素评分根据本研究的调查量表在患者入院第二天进行中医证候要素评分。
       2.4  统计学方法 
       统计分析采用SPSS11.0统计分析软件。计量资料采用±s进行统计描述，采用t检验或方差分析（ANOVA）或Wilcoxon秩和检验进行比较，病因学分析采用相关性检验的方法。P＜0.05被认为有统计意义。
       3  结 果
       3.1  血淤证与非血淤证患者的血清MMP-9、TIMP-1比较脑梗塞患者血清MMP-9比较，血淤证组较非血淤证组显著升高（P <0.01）；TIMP-1比较，血淤证组与非血淤证组均无显著差异（P >0.05）。结果见表1。表1  脑梗塞患者血淤证与非血淤证的血清MMP-9、TIMP-1比较（略）
       3.2  血淤证与非血淤证患者的血清MMP-9动态时点变化比较在脑梗塞急性期的4个时点中，血淤证患者血清MMP-9在前3 d呈升高趋势，在72 h以后开始下降。与第1天相比，第3天明显升高（P<0.01），其它时点比较均无显著差异（P>0.05）。非血淤证患者血清MMP-9在前两天呈升高趋势，在第3天下降后又呈升高趋势。与第2天相比，第1天显著降低（P<0.01），其它两个时点均有差异（P<0.05）。结果见表2。表2  脑梗塞患者血淤证与非血淤证的MMP-9动态变化比较（略）
       3.3  血淤证与非血淤证患者的血清TIMP-1动态时点变化比较在脑梗塞急性期的4个时点中，血淤证患者的血清TIMP-1呈逐渐升高趋势，72 h较24 h显著升高（P<0.01），其它时点比较无显著差异（P>0.05）。非血淤证患者血清TIMP-1未显示变化趋势，各时点比较无显著差异（P>0.05）。结果见表3。表3  脑梗塞患者血淤证与非血淤证的TIMP-1动态变化比较（略）
       3.4  血清MMP-9、TIMP-1与血淤证的相关性血淤证与MMP-9的Spearman相关系数为0.287，两者相关性有显著意义（P<0.01）。血淤证与TIMP-1无明显相关（P>0.05）。结果见表4。表4   血淤证与动脉粥样硬化活性物质的相关性（略）
       4  讨论
          
       基质金属蛋白激酶（matrix metalloproteinase，MMPS）是一组由结缔组织细胞分泌的Zn2+依赖性蛋白水解酶家族，目前已经发现的MMPS约60种，人类大约二十多种，其主要功能是降解和重塑造细胞外基质［8］。MMP-9是明胶酶的一种，分子量92 kD，故又称92 kDⅣ型胶原。MMP-9是很多生理过程的关键调节剂，如参与骨骼形成、血管发生、伤口愈合、血液凝固及子宫组织重塑等［9］。MMP-9的调控主要通过基因转录、酶原激活及MMP-9生理性抑制物(TIMP-1)3个水平实现。由于动脉粥样硬化斑块是由纤维帽及脂质核心构成，而纤维帽的厚度和脂质核心的大小是维持斑块稳定性的重要因素。研究表明，动脉粥样硬化斑块内表达增多，纤维成分大量降解，使斑块破溃，形成附壁血栓，并容易脱落，从而导致脑梗塞等疾病发生［10］。研究报道动脉硬化斑块的破裂部分取决于MMP-9的活性和数量，在不稳定的颈动脉斑块中，MMP-9的浓度、产物及表达都明显增高［11］。MMP-9通过血管中膜平滑肌细胞迁移、增殖凋亡及细胞外基质的重塑在动脉粥样硬化斑块的形成、发展及破裂中发挥了重要作用。MMP-9的过度表达则抑制平滑肌增殖，促使其凋亡，破坏了斑块的稳定性。TIMPs是组织中MMPs 主要的内源性抑制因子，MMPs /TIMPs之间的平衡在ECM的重建中发挥着极其重要的作用。TIMP-1为可溶性蛋白质分子，由结缔组织细胞和巨噬细胞产生，同时多种细胞因子能诱导其分泌［12］。在不稳定粥样斑块中常见到巨噬细胞增多，MMP-9分泌增加，使基质降解增强，TIMP-1对有MMP-9产生的基质降解起着很重要的平衡作用，纤维帽的胶原分解与否取决于MMP-9与TIMP-1之间衡状态［13］。因此，MMP-9及TIMP-1可以作为颈动脉粥样硬化及斑块不稳定的标记物。
       
       本研究结果显示脑梗塞患者血清MMP-9比较，血淤证组较非血瘀证组显著升高；在脑梗塞急性期的4个时点中，血瘀证患者血清MMP-9在前3 d呈升高趋势，在72h以后开始下降。与第1天相比，第3天明显升高，其它时点比较均无显著差异。以上结果提示脑梗塞血淤证患者血清MMP-9升高，在急性期前3 d呈升高趋势，72 h后下降。另一项结果显示TIMP-1比较，血淤证组与非血淤证组均无显著差异。在脑梗塞急性期的4个时点中，血淤证患者的血清TIMP-1呈逐渐升高趋势，72 h较24 h显著升高，其它时点比较无显著差异。提示脑梗塞血淤证患者血清TIMP-1在急性期表达呈逐渐升高趋势，但与非血淤证比较无差异。相关性结果显示脑梗塞血淤证与MMP-9的Spearman相关系数为0.287，两者相关性有显著意义，而血瘀证与TIMP-1无明显相关。该项结果提示脑梗塞血淤证与MMP-9呈正相关，随着MMP-9升高，血淤证的程度加重。TIMP-1与脑梗塞血淤证无明显相关，血淤证的TIMP-1含量及变化也未显示特异性，考虑可能与样本含量有关，也可能与MMP-9与TIMP-1之间的动态平衡影响因素较多有关。
       
       本研究探讨血淤证与脑梗塞患者血清MMP-9及TIMP-1的相关性，发现了血清MMP-9与血淤证呈正相关，在脑梗塞急性期前3 d呈升高趋势，72 h后下降，随着MMP-9升高，血淤证的程度加重，且血淤证与血清TIMP-1无明显相关。尽管本研究有了新的发现，但由于样本含量过少，证候之间的差异仅开展了血瘀证与非血淤证的探讨，未能进一步从各个证候之间的层面开展分析，如血淤证与气虚证、与肝风证等，给研究结果带来了局限性，对结果分析具有一定的影响。因此，在下一步的研究中，我们将扩大研究样本，探讨各证候间血清MMP-9及TIMP-1的差异，进一步探讨两者的相关性。
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