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       【摘要】 
       目的建立蚕蛹蛋白氨基酸含量的测定方法。方法采用柱前衍生反相高效液相色谱法。结果在给定的色谱条件下，18种氨基酸在35 min内获得了较好的分离，在一定浓度范围内，氨基酸的峰面积与浓度的线性相关系数在0.990 6～0.999 8之间，相对标准偏差为2.02%～5.45%(n=5)。并测定了蚕蛹蛋白中氨基酸的组成和含量。结论该方法准确可靠、重复性好，可用于蚕蛹蛋白中氨基酸含量的测定。
       【关键词】  蚕蛹蛋白; 氨基酸; 高效液相色谱法
       Determination of Amino Acids in Protein of Silk Worm by Reversed- phase High Performance Liquid Chromatography
       JIN Weiwei1, ZHAO Zhongxing1, LIU Xuhui1,2, LUO Zhenyu1, ZHANG Lei1, WEI Qiaona1, LIAO Dankui1*
       (1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University, Nanning Guangxi, 530004, China;
       2. Department of Chemistry and Life Sciences, Hechi University, Yizhou, Guangxi, 546300, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for determination of amino acids in proteins of silk worm. MethodsA reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of amino acids was described. ResultsThe mixture of 18 kinds of amino acids was characterized by HPLC in 36 min. The response was linear for all amino acids with a correlation coefficient of 0.990 6～0.999 8, method precisions (n=5) for the different amino acids were between 2.02%～5.45% (relative standard deviation, RSD). Using this method, 18 kinds of amino acids in protein of silk worm were determined. ConclusionThe method is accurate, reliable and repeatable for the determination of amino acids in proteins of silk worm.
       Key words：Protein of silk worm; Amino acids; HPLC
       蚕蛹(Bombyxmori L.)作为药用在我国有悠久的历史。现代研究表明，蚕蛹具有较高的营养价值，其中蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质，不仅含有人体所需的8种必需氨基酸，且氨基酸配比均衡性好，国内已有厂家将蚕蛹水解制成复合氨基酸产品[1]。因此测定蚕蛹氨基酸组成，对以蚕蛹蛋白为原料进一步开发功能产品具有重要的参考价值。
       目前，对氨基酸的测定除采用氨基酸自动分析仪外[2]，柱前衍生反相高效液相色谱法测定氨基酸的技术也得到了很大的发展，且具有快速灵敏、不需专用仪器等优点[3]。高效液相色谱法分析氨基酸时常用的柱前衍生试剂如OPA(邻苯二甲醛)、DANSYL_Cl(丹磺酰氯)、FMOC(9-芴甲基氯甲酸酯)和PITC(异硫氰酸苯酯)等各有优点和缺陷[4～6]。其中因为OPA 衍生步骤简单, 反应速度快, 剩余试剂不干扰测定, 衍生物可用紫外、荧光或电化学检测器检测，故其应用最广，但由于不能和仲氨酸反应，而FMOC 能与仲氨酸反应，因此将OPA-FMOC联用可克服两者单独使用时的缺点。本实验以OPA及FMOC为柱前衍生化试剂，利用二极管阵列(DAD)在同一通道用338 nm 和262 nm 双波长检测, 同时检测样品中的一级和二级氨基酸，建立了蚕蛹蛋白质氨基酸分析的方法。1 仪器与试剂
       Agilent1100高效液相色谱仪，配四元泵及真空在线脱气机，美国安捷伦科技有限公司产品;CSF-1型超声波清洗器，上海超声波仪器厂产品;101AS-2型电热恒温干燥箱，上海实验仪器有限公司产品。
       18种氨基酸标准品、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为进口分装产品;3-巯基丙酸(3-MPA)由Alfa Aesar公司，邻苯二甲醛，醋酸钠，三乙胺等为国产分析纯，上海国药试剂有限公司产品;甲醇，乙腈，四氢呋喃为色谱纯，天津四友色谱试剂厂产品。
       2 方法
       2.1 试剂配制流动相A：20 mmol/L 醋酸钠缓冲液(含0.5%四氢呋喃及0.3‰三乙胺，pH=10.3)，0.45 μm滤膜过滤，备用;流动相B：甲醇;流动相C：乙腈。衍生剂A(OPA试剂)：取270 mg OPA试剂，溶于2ml无水乙醇中，加入100 μl 3-巯基丙酸，0.2 mol/L硼酸缓冲液(pH 10.8)定容至50 ml，4℃避光保存。衍生剂B(FMOC试剂)：取10 mg FMOC试剂，乙腈定容至10ml。氨基酸标准溶液：18种氨基酸标准品各25 mg，0.1 mol/L HCl溶解定容至25 ml，摇匀，4℃保存。
       2.2 水解 称取适量经一次脱脂的蚕蛹(约含蛋白质50 mg)于安瓿瓶中，加入6 mol/L HCl 5 ml ，抽真空封口，于110℃水解24 h，开口后在真空干燥器中去酸，定容至25ml，冷冻保存。因某些氨基酸如色氨酸、组氨酸等在酸性条件下容易被破坏[7]，需另取一定量的样品经6 mol/L NaOH于安瓿瓶中真空水解24 h，6 mol/L HCl中和，定容至25 ml，冷冻保存。
       2.3 衍生分别取20 μl氨基酸标准液和样品水解液置于2ml的Eppendorf管中，加入70 μl的衍生剂A和10 μl的衍生剂B，振荡2 min后，经0.22 μm过滤膜过滤后进样。
       2.4 色谱分析条件色谱柱为Agilent Eclipse AAA 氨基酸分析柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，DAD二极管阵列检测器， 1～32 min检测波长为338 nm，32 min后检测波长为262 nm，柱温为35℃，按在表1中的条件进行梯度洗脱。表1 流动相梯度洗脱程序
       2.5 样品的定性与定量 样品的定性采用保留时间法，即在相同的色谱分析条件下，样品中氨基酸的色谱峰与氨基酸标准的色谱峰保留时间相同或者相近，则认为样品中含有此氨基酸。样品的定量采用标准曲线法，即配制一定浓度氨基酸混合溶液，得出各氨基酸与其峰面积之间的线性回归方程，在同样的色谱分析条件下，对样品中的氨基酸进行分析，根据峰面积与线性回归方程得出样品中氨基酸的浓度[8]。
       3 结果
       3.1 氨基酸混合标准样品的分析结果 在流动相(A)中加入适量的四氢呋喃(THF)可显著改善氨基酸的OPA衍生物在Eclipse AAA柱上的分离效果[8]。加入三乙胺可显著改善峰型并减小峰宽，降低实验误差，经多次实验确定THF和三乙胺的最佳加入量分别为0.5%和0.03%。 由于OPA衍生一级氨基酸，FMOC衍生二级氨基酸，将18种氨基酸混合标准溶液衍生化后按表1的色谱条件进样分析。结果见图1。
       1-Asp 2-Glu 3-Ser 4-His 5-Gly 6-Thr 7-Ala
       8-Arg 9-Tyr 10-Cys 11-Val 12-Met 13-Trp
       14-Phe 15-Ile 16-Leu 17-Lys 18-Pro
       图1 氨基酸标准混合液高效液相色谱图
       取不同浓度的氨基酸标准溶液进行衍生和分析，以峰面积为纵坐标，氨基酸的进样量为横坐标，作标准曲线。各氨基酸的标准曲线及其它结果见表2。18种氨基酸混合标准溶液连续5次进样分析，各氨基酸保留时间的相对标准偏差为0.05%～3.0%，峰面积的相对标准偏差在1.9%～5.4%之间。结果表明，每种氨基酸进样量在0.04～0.3μg范围内时，其线性相关系数在0.990 6～0.999 8之间，具有良好的线性关系，由于利用Eclipse AAA 氨基酸专用分析柱分离，与ODS通用色谱柱相比，其分离效果和稳定性更好[9]。　表2 氨基酸的保留时间、线性范围、回归方程、相关系数及精密度
       3.2 样品分析及结果在与氨基酸混合标样相同的实验条件下，进行蚕蛹蛋白盐酸水解液和氢氧化钠水解液的样品分析，图2为酸解蚕蛹蛋白的氨基酸液相色谱图，通过标准曲线计算出蚕蛹蛋白中氨基酸的含量如表3。实验结果表明蚕蛹蛋白中的18种氨基酸在其色谱条件下除色氨酸和苯丙氨酸外完全分离。
       从表3可知蚕蛹蛋白中18种氨基酸的含量都在15 mg/g蛋白质以上，品种齐全，8种必需氨基酸缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸占总量的60%，且必需氨基酸和l8种氨基酸的配比的含量均符合联合国粮农/世界卫生组织(FAO/WHO)所规定的理想蛋白质模式[10]。同时蚕蛹蛋白中非极性氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甘氨酸含量占总氨基酸含量的27.5%，芳香氨基酸苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸含量占总氨基酸含量的13.8 %，这两类氨基酸组成共占氨基酸总组成的 41.3%。对于以蛋白质为原料开发如降血压肽等功能食品，若选择蚕蛹蛋白为原料，就一般规律而言，有可能得到高活性的降血压肽。表3 蚕蛹蛋白中的氨基酸含量
       4 结论
       建立了OPA和FMOC试剂联用柱前衍生的高效液相色谱分析方法，在35min内18种常见氨基酸可获得较好的分离。用峰面积定量计算其重复性和精密度较好。
       在相同实验条件下，检测了蚕蛹蛋白质中氨基酸的组成和含量，表明蚕蛹蛋白氨基酸品种齐全，必需氨基酸和l8种氨基酸的配比的含量均符合联合国粮农/世界卫生组织(FAO/WHO)所规定的理想蛋白质模式，蚕蛹蛋白中非极性氨基酸和芳香氨基酸含量占氨基酸总组成的 41.3%，可作为开发功能食品的优质原料。
       【参考文献】
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