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       【摘要】 
       目的通过比较两种生长剂影响北虫草生长状况，优化选择生长剂以达到提高北虫草的栽培质量。方法在菌种接种前分别加入两种生长剂(生长剂-Ⅰ和生长剂-Ⅱ)，观察菌丝铺瓶面积，转色颜色，菌蕾形成，子实体出芽时间和密度，测量子实体高度和鲜草重量。结果第30天，对照组平均出芽密度24棵，芽高3.03cm，鲜草重量8.0 g。而实验组生长剂-Ⅰ平均出芽密度30棵，芽高4.26cm，鲜草重量11.8 g。实验组生长剂-Ⅱ平均出芽密度44棵，芽高4.79 cm，鲜草重量14.3 g。两组实验组与对照组比较，出芽密度和芽生高度及生长剂-Ⅱ实验组的鲜草重量有显著性差异(P<0.05)。结论该文研究的生长剂-Ⅱ对北虫草的菌丝生长、转色、菌蕾形成、子实体出芽时间、子实体密度和子实体高度产生的影响优于生长剂-I，生长剂-Ⅱ能够达到提高北虫草的栽培质量的目的。
       【关键词】  北虫草; 生长剂; 子实体; 培养基
       A Comparative Study on Effect of Two Plant Growth Promoters on the Growth of Cordyceps militaris
       WANG Hongjun1, CHU Zheng2, FENG Li1, WANG Liqiang1, ZHANG Zhiqiang1, WU Yimin1, LI Chunyan3
       (1.Center of Disease Prevent and Control of Shenyang Military Command, Shenyang, 110034, China; 2.Chief Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, China; 3.Zhong Tian Biotechnological Company, Shenyang 110016,China)
       Abstract：ObjectiveTo compare the effects of two plant growth promoters on the growth of Cordyceps militaris.MethodsThe two plant growth promoter(-Ⅰ and –Ⅱ) were separately added into medium before Cordyceps planted. Then mycelia area in bottles, colour transformation and rimordium formation time were observed, sporophore embryo time and density were recorded, sporophore height and weight were measured.ResultsOn the 30th day, sporophore embryo average density was 24, the average altitude was 3.03 centimetres, and the weight was 8.0 gram in control group, but sporophore embryo average density was 30, the average altitude was 4.26 centimetres, and the weight was 11.8 gram in test group( plant growth promoter-Ⅰ). Sporophore embryo average density was 44, the average altitude was 4.79 centimetres, and the weight was 14.3 gram in test group( plant growth promoter-Ⅱ). Both of test groups were marked and had the statistic significance (P<0.05) compared to control group.ConclusionPlant growth promoter-Ⅱ has effects on the mycelia growth, colour transformation, rimordium formation, sporophore embryo time and density and sporophore height. Especially, that plant growth promoter-Ⅱ can heighten quality production of Cordyceps militaris and is superior to the plant growth promoter-Ⅰ.
       Key words：Cordyceps militaris; Plant growth promoter; Sporophore; Medium
       北虫草为冬虫夏草同属药食两用真菌,含有丰富的蛋白质，21种微量元素，9种维生素和虫草菌素、虫草酸、虫草多糖、SOD酶及核酸衍生物等[1]，是有机维生素与氨基酸的天然宝库，具有良好的医用价值和保健作用。近年来，国内外市场消费需求增加，特别是在日本与南亚国家深受欢迎，久盛不衰。以虫草为原料开发的药品、保健品和食品正处在发展势头。鉴于野生资源不能满足日益增长的需求，取而代之的是人工驯化栽培的北虫草产业迅猛崛起，为了进一步提高人工栽培虫草的质量和产量，本课题组利用自行研制的两种生长剂初步观察探讨了它们对虫草菌丝生长和子实体形成的影响，研究的两种生长剂目前国内外均未见报道。本研究的最终目是通过在栽培过程中加入生长剂，达到大规模批量生产，为研发药品、保健品和食品提供虫草原料。
            1 材料
       1.1 培养基原料虫草栽培固体培养基;市售普通大米，自来水。生长剂-Ⅰ(主要原料为动物蛋白、植物生长因子与K+，Na+，Ca2+，Mg2+等离子，pH 7.0)，生长剂-Ⅱ(动物蛋白基本同生长剂-Ⅰ ，但植物生长因子和金属离子激活剂不同，pH 6.0)，为自行研制。
       1.2 供试菌株北虫草Cordyceps militaris菌种由沈阳中天生物工程有限公司李春燕教授惠增，菌种药号：国家食品药品监督管理局审批的人工北虫草药材研究(批件号2003L01393、药物临床研究号2003L01394)。
       2 方法
       2.1 培养基的配制与灭菌分别称取大米30 g，自来水45 ml加入750 ml罐头瓶中(共计21瓶，对照组、实验组生长剂-Ⅰ和生长剂-Ⅱ各7瓶)，瓶口用薄厚为3.5个道的耐高压聚丙烯薄膜覆盖，耐压皮筋套勒紧瓶口，置室温(16±2)℃浸泡4～6 h，高压灭菌，待高压锅煮沸放出冷气后闭放气阀，上磅0.15 MPa 40 min后熄火，下磅待凉后接种。
       2.2 接种与培养条件接种前接种室紫外线灭菌30 min，接种过程严格遵守无菌操作规程，分别加入生长剂2 ml /每瓶(pH 6.0和7.0)，再接菌种0.5 ml/每瓶(菌丝∶液体=4∶5)。菌种为振摇培养5 d的1级菌种，菌液清澈透明，菌球谷粒大小，呈白色，半透明状。置室温条件下[昼夜波动范围在(13～20)℃]避光培养，室内湿度波动范围在30%～60%，以温度湿度计为计量标准[2，3]。
       2.3 观察生长剂对北虫草菌生长影响的状况主要观察菌丝铺瓶面积，转色时间，颜色深浅，菌蕾形成和子实体胚芽萌发时间，子实体出芽密度，生长高度与最终获鲜草重量。每间隔10 d，记录统计上述指标。
       2.4 统计学处理方法各组数据用百分数和平均数()表示，两组间比较采用t检验。
       3 结果
       3.1 虫草菌在米饭培养基生长第10天菌丝铺瓶面积与转色观察实验结果(见表1)。第10天，对照组菌丝铺瓶面积 0.5≥0.6占80%(分数表示法)，转变为白黄色的达100%，实验组生长剂-Ⅰ 菌丝铺瓶面积 0.8≥0.9占70%，转变为金黄色的达80%，实验组生长剂-Ⅱ菌丝铺瓶面积≤0.9 占90%，转变为金黄色的达100%。两组实验组与对照组比较，有显著性差异(P<0.05)。表1 第10天两种生长剂的实验效果观察与对照组比较，*P<0.05; n=7
       3.2 虫草菌在米饭培养基生长第20天菌蕾形成与出芽观察结果见表2。第20天，对照组菌蕾形成与胚芽萌发情况均为阴性，而实验组生长剂-Ⅰ 可见菌蕾形成的占70%(7/10)，胚芽萌发达到60%(6/10)。实验组生长剂-Ⅱ 菌蕾形成的占100%(10/10)，胚芽萌发达到80%(8/10)。两组实验组与对照组比较，有显著性差异(P<0.05)。表2 第20天两种生长剂的实验效果观察与对照组比较,*P<0.05;n=7
       3.3 虫草菌在米饭培养基生长第30天出芽密度、芽高与60 d鲜草重量观察记数每瓶虫草棵数，并用直尺测量生长高度(cm)与每瓶鲜草的重量(g)。结果见表3和图1。第30天，对照组平均出芽密度24棵，芽高3.03cm，鲜草重量8.0 g。而实验组生长剂-Ⅰ平均出芽密度30棵，芽高4.26cm，鲜草重量11.8 g。实验组生长剂-Ⅱ平均出芽密度44棵，芽高4.79cm，鲜草重量14.3 g，其中矮细小的不在记录范围。两组实验组与对照组比较，出芽密度和芽生高度及实验组生长剂-Ⅱ的鲜草重量有显著性差异(P<0.05)。表3 第30天两种生长剂的实验效果与第60天鲜草重量观察
       4 讨论
       本文研究表明，在培养基、温度、湿度与光照同等条件下，本课题组研制的两种生长剂，对北虫草菌丝生长、颜色、菌蕾形成、胚芽萌发时间、出芽密度、芽生高度和最终获得鲜草重量与对照组比较均有明显的变化。加入生长剂-Ⅰ后，北虫草菌丝生长、颜色变化、菌蕾形成、胚芽萌发时间早于对照组3～5 d，出芽密度和芽高也明显优于对照组，但最终获鲜虫草重量虽有差别，但无统计学意义。而加入生长剂-Ⅱ后，北虫草菌丝生长、颜色变化、菌蕾形成、胚芽萌发时间早于对照组5～7 d，出芽密度和芽生高度也明显优于对照组，最终获鲜虫草重量明显优于对照组与生长剂-Ⅰ实验组。分析其原因，野生的北虫草嗜好生长在pH5.4～6.8范围内的酸性环境[4]，尽管米饭培养基的偏酸性和碳水化合物能使北虫草菌丝生长，形成子座，但人工培养基与天然有机生命体作为虫草菌的寄生宿主，应该说二者的差别相距甚远。在本实验所研究的两种生长剂中除pH值不同外，植物生长因子与离子激活剂的不同也可能是造成不同结果的主要原因。也有许多研究报道，在米饭培养基加入各种动植物蛋白和维生素等，但结论各异，迄今未达成统一标准[5，6]。本文研究的生长剂都可以使虫草菌在菌丝生长阶段良好，生长速度快，也可以使菌蕾和胚芽萌发早，芽生密度高，特别是生长剂-Ⅱ最终提高了北虫草的产量。本实验观察结果表明，在米饭培养基中加入本实验研究的生长剂-Ⅱ，可以满足北虫草子实体生长所需要营养，它在栽培的过程中缩短了生长周期的同时提高了北虫草子实体的产量，生长剂-Ⅱ的实用价值值得推广。
       【参考文献】
         　[1] 李春燕.辽宁虫草，第1版[M].中国香港：亚洲医药出版社，2005，9：42.
       
       [2] 王厚龙，宫国辉.蛹虫草的人工栽培技术[J].人参研究，2006，1：33.
       
       [3] 王常鑫，杨春伟.虫草的人工栽培工艺研究[J].实用药物与临床，2006，9(2)：111.
       
       [4] 刘振祥，张 胜.食用菌栽培技术，第1版[M].北京：化学工业出版社，2007，7：186.
       
       [5] Dong CH, Yao YJ.Nutritional requirements of mycelial growth of cordyceps sinensis in submerged culture[J].J Appl Microbiol, 2005，99(3): 483.
       
       [6] Kim HO, Yun JW.A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures[J].J Appl Microbiol, 2005，99(4): 728.