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       【摘要】 
       目的研究纤维素酶在提取长春花生物碱中的应用。方法采用酸水浸提法和酶浸提法提取长春花中的长春碱、长春质碱、文多林，高效液相色谱(HPLC)法测定其含量。结果酸水浸提法和酶浸提法提取的长春碱、长春质碱、文多林含量分别为0.0158和0.0052 mg/ml;0.0456和0.0204 mg/ml;0.0898和0.0421 mg/ml。结论在单位时间内酶提法可显著提高长春碱、长春质碱、文多林的收率，可考虑将酶解法用于工业上长春花生物碱的提取中。
       【关键词】  长春花; 长春碱; 长春质碱; 文多灵; 纤维素酶
       Extraction of Alkaloid from Catharanthus roseus by Enzymatic Method
       HE Jichan， DONG Zhichao*， WANG Jianrong， YAN Xiaoxia
       (Germplasm Research Institute of Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture P.R. of China, Danzhou, Hainan 571737)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of cellulose enzyme on extraction of alkaloid from Catharanthus roseus.MethodsHPLC method was used to determine the contents of vinblastine, catharanthine and vindoline from C. roseus.ResultsCompared with the traditional acidic water extraction, the enzymatic method extraction yield of vinblastine, catharanthine and vindoline was increased respectively.ConclusionThe yield of vinblastine, catharanthine and vindoline from C. roseus can be effectively increased by using enzymatic extraction process. It is available to use enzyme in extraction alkaloid from C. roseus.
       Key words：Catharanthus roseus; Vinblastine; Catharanthine; Vindoline; Cellulose enzyme
       长春花Catharanthus roseus (Linnaeus) G. Don是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属一种重要的药用植物。长春花植株中含有极其复杂的萜类吲哚生物碱家族，其中的长春碱(Vinblastine)为目前应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物之一，可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤等疾病[1，2]。而长春质碱(Catharanthine)、文多林(Vindoline)是半合成另一癌症治疗一线药物长春瑞滨的原料[3]。目前工业上长春花生物碱的提取方法主要为酸水浸提法，该方法存在着有效成分提取率低、耗时较长的问题。近年来，纤维素酶的应用日益广泛，特别是在提取天然产物中的有效成分，纤维素酶可将植物细胞壁破坏并将纤维素软化，能使细胞内的有效物质充分释放出来，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率[4]。本实验用纤维素酶浸提长春花粉末提取长春花生物碱，显著提高了长春碱、长春质碱、文多林的提取率，缩短了提取时间，且用纤维素酶提取长春花生物碱尚无同类报道。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器 Waters 1525型高效液相色谱仪，2487型紫外检测器;电子天平BT2202S(日本岛津);PB20型精密pH计(上海雷磁仪器厂)。
       1.2 试药 纤维素酶(天津奥凯实业有限公司);长春碱、长春质碱、文多林(纯度≥98%)，均为自制;长春花采于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药种质圃;甲醇、乙腈为色谱纯，氨水、二乙胺、磷酸为分析纯，水为二次蒸馏水;所有试剂在使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil BDS-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱;流动相为380 ml水-二乙胺(986∶14，用磷酸调pH 7.2)与620 ml甲醇-乙腈(4∶1)混合;流速1.0 ml/min;柱温为25℃;检测波长260 nm;进样量10 μl。色谱图见图1。
       1.文多林 2.长春质碱 3.长春碱
       图1 混合对照品(A)和长春花酶提取样品(B)的HPLC图谱
       2.2 标准品溶液的制备 精密称取适量长春碱、长春质碱、文多林对照品，用5 ml甲醇溶解并置于同一容量瓶中，摇匀，用甲醇定容。三者配置的浓度分别为0.358 6，0.484 2和0.954 6 mg/ml。保存于4℃冰箱备用。
       2.3 供试品溶液的制备
       2.3.1 酸水浸提法精密称取长春花全草粉末20 g，精密加入pH 4.0的酸水溶液200 ml，置于恒温水浴12 h。滤过，滤液加氨水调pH值至8.0，以200 ml的四氯化碳分5次等量萃取，合并萃取液挥干。残渣加甲醇适量溶解，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度。置冰箱备用，上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。
       2.3.2 酶浸提法精密称取长春花全草粉末20 g，精密加入含0.5 g纤维素酶pH 4.0的酸水溶液200 ml，置于恒温水浴12 h。后续处理方法同酸水浸提法。
       2.4 线性关系考察分别精密量取上述对照品溶液各0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml分别置于10 ml容量瓶中，摇匀，用甲醇定容。精密吸取各浓度溶液10 μl注入液相色谱，按“2.1”项下色谱条件测定相应HPLC图谱的峰面积。以长春碱、长春质碱、文多林进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。表1 各长春花生物碱标准曲线回归方程和线性范围
       2.5 精密度实验上述条件下，对同一混合对照品溶液重复测定7次，测得峰面积的RSD分别为：长春碱0.58%，长春质碱0.82%，文多林0.54%，说明精密度较好。
       2.6 重复性实验对同一批样品按供试品溶液的制备方法平行制备5份，分别进样10 μl，同时取混合对照品溶液10 μl进样测定，按外标法测定其含量，结果证明重复性良好，RSD分别为:长春碱0.56%，长春质碱0.45%，文多林1.3%。
       2.7 稳定性实验按“2.1”项下色谱条件，对同一供试品，在保存0，4，8，12，24 h后，用当日新配置的对照品溶液按外标法测定相应的峰面积，并计算长春碱、长春质碱和文多林的RSD分别为:长春碱0.89%，长春质碱0.76%，文多林0.38%，说明这3种成分在24h内稳定。
       2.8 回收率实验分别精密称取已知含量的同一长春花全草粉末6份，分别定量加入混合对照品溶液各0.5，0.5，1.0，1.0，2.0，2.0 ml，按样品溶液制备方法回收供试品溶液，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表2。表2 各长春碱回收率实验结果
       2.9 样品含量测定精密吸取经0.45 μm滤膜滤过的样品溶液10 μl，分别注入高效液相色谱仪中，根据峰面积由标准曲线计算出两种方法提取的长春碱、长春质碱、文多林含量。两种方法提取长春碱、长春质碱、文多林含量结果见表3。表3 长春花提取液中各生物碱含量的测定结果
       3 结论与讨论
       从纤维素酶提取长春花中长春碱、长春质碱、文多林实验中，可以初步看出，在纤维素酶的作用下，长春碱、长春质碱提取量大大提高，由t检验可以看出P<0.01，两种工艺提取方法对比，有显著差异。由于实验是在实验条件完全平行的情况下进行，因此可以否认由于实验不平行引起的提取量的差异。
       用纤维素酶酶解后提取，长春碱、长春质碱的提取量比酸水浸提法提高了近3倍，而文多林的提取量也有少量增加，这是由于纤维素酶具有分解纤维素、破坏细胞壁的作用，使被细胞壁包裹的成分易于溶出。
       实验发现，用酸水浸提6 h后，文多林的提取率变化就不明显，而长春碱、长春质碱至少经10 h的酸水浸提，才能有效溶出。
       本实验是在一定的酶量和温度下进行，是否应该进行正交实验进一步优化提取条件有待进一步的研究。是否将酶法用于长春花提取的工业化中，还因考虑酶对提取物有何影响，是否会引起药理作用的变化等，都有待进一步的深入研究。
       【参考文献】
         　[1] 徐任生，陈仲良. 中草药有效成分提取与分离[M]. 上海：上海科学技术出版社，1983： 280.
       
       [2] 季宇彬. 中药有效成分药理与应用[M]. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1995：488.
       
       [3] 罗 猛，付玉刚，祖元刚，等. 反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱[J]. 分析化学，2005，33(1)：87.
       
       [4] 韩 丽. 实用中药制剂新技术[M]. 北京：化学工业出版社，2002：116.