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       【摘要】 
       目的研究毒蕈环肽a-amanitin对人肝癌细胞SMMC-7721的体外毒性作用。方法运用MTT法研究α-amanitin不同浓度和不同作用时间对体外传代培养的人肝癌细胞SMMC-7721的抑制增殖作用，再进行环肽α-amanitin对细胞毒性作用的数学模型拟合。 结果研究发现，α-amanitin的使用剂量与细胞存活率存在负相关。7.12×10-4 mmol/L 和7.12×10-10 mmol/L α-amanitin对SMMC-7721作用24 h后，细胞存活率分别为71.25%和87.47%，作用效果分别与10 mmol/L和2.5 mmol/L 环磷酰胺相似。SMMC-7721细胞存活率平方根的反正弦值与α-amanitin浓度的对数变换值的相关和回归分析结果显示二者显著性相关，曲线拟合结果显示三次曲线模型拟合最好，回归方程为Y=31.257 7-12.902X-1.5117X2-0.0616X3。对SMMC-7721细胞存活率平方根的反正弦值与α-amanitin作用时间进行相关和回归分析，二者显著性相关，三次曲线模型拟合最好，对应回归方程为Y=89.668 5-8.616 6X+1.791X2-0.1271X3。结论环肽a-amanitin对人肝癌细胞SMMC-7721体外增殖有显著抑制作用，且单位摩尔数的α-amanitin抑制作用远强于单位摩尔数的环磷酰胺。
       【关键词】  α-amanitin; SMMC-7721; 细胞毒性
       Inhibitory Effect of Cyclopeptide α-amanitin on Human Hepatoma SMMC-7721 Cells
       CAO Mei1, YAN Liang2, NEI Yuanyang2, FENG Su2, ZHANG Jie2, HOU Ruotong2, SUN Qun2, YANG Zhirong2, ZHAO Jian2
       (1.Core Laboratory, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, P. R. China; 2.Key Laboratory of Biological Resource and Ecological Environment of the Ministry of Education, College of Life Science, Chengdu 610064, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of cyclopeptide α-amanitin on human hepatoma SMMC-7721 cells. MethodsThe SMMC-7721 cells were treated with different concentration and duration of α-amanitin. The cell survival rate (CRS) of SMMC-7721 cells was examined by MTT assay in vitro, and the relative results were fitted with mathematical model. ResultsThe cell survival rate was reversely correlated with the concentration of α-amanitin. The cell growth was restrained strikingly when the cells were treated by 7.12×10-10 mmol/L α-amanitin for 24 h. The cell survival rate were 71.25% and 87.47% after treating with 7.12×10-4 mmol/L and 7.12×10～10 mmol/L α-amanitin for 24 h, respectively. The arcsine transformation of the CSR square root and the logarithmic transformation of α-amanitin concentration were correlated and regressed. The curve fitting showed that the cubic model was the best one. The regression equation was Y=31.257 7-12.902X-1.511 7X2-0.061 6X3. The arcsine transformation of the CSR square root and the action time of α-amanitin were correlated and regressed. The correlation was also significant and the cubic model was the best one. The cubic regression equation was Y=89.668 5-8.6166X+1.791X2-0.1271X3. ConclusionThe cyclopeptide α-amanitin has significant inhibitory effect on human hepatoma SMMC-7721 cells, and its toxicity is much stronger than cyclophosphamide.
       Key words：α-amanitin; SMMC-7721; Cytotoxicity
       中国有丰富的大型真菌资源，采食、种植这些药食真菌的子实体以用于食品和医药历史悠久。现在该领域新的发展趋势和重点研究内容之一是从这些大型真菌中分离、鉴定活性分子，其中包括有毒蕈菌[1～3]。中国有记述的毒蘑菇有近五百种，诸如毒鹅膏菌(A. phalloides)、白毒鹅膏菌(A. verna)、鳞柄白毒鹅膏菌(A. virosa)等。鹅膏属毒蕈原浆质毒素根据其结构、性质主要分为鹅膏毒肽(amatoxins)、鬼笔毒肽(phallotoxins)和毒伞素(virotoxins)三类，这些毒肽都是环化小分子，化学性质稳定[4]。其中环肽α-amanitin是鹅膏毒肽中含量最高的毒素之一，可应用于研究真核细胞基因的组织结构、功能、表达及调控，获取病毒在细胞中复制信息[5～8]。另外，α-amanitin在特异性控制和治疗肿瘤领域也具有广阔前景，Grna报告了用α-amanitin治愈氨基偶氮甲苯诱发的小鼠皮肤肿瘤的成果，在MDA PCA 2b细胞中，雄性激素诱导的CRYM基因表达受到α-amanitin的抑制，并且α-amanitin作用骨肉瘤细胞后可以导致其mRNA降解[9，10]。
       环磷酰胺(cyclophosphamide，CY)是人工合成的氮芥类烷化剂，是细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药，进入体内被肝脏或肿瘤内存在的过量磷酰胺酶或磷酸酶水解，转变为活化的磷酰胺氮芥而起作用，其作用机制与氮芥相似，与DNA发生交叉联结，抑制DNA的合成，也可干扰RNA的功能。毒蕈毒素环肽α-amanitin也有与之相类似的生物学性质，诸如倾向性作用于肝脏等。为了进一步弄清α-amanitin对肝癌细胞的生物学活性，本文以环磷酰胺为阳性对照，进行α-amanitin对体外传代培养肝癌细胞的实验研究，以阐明该多肽对肝癌细胞的毒性效应，为以后应用和开发该多肽提供试验依据。
       1 材料与方法
       1.1 材料与仪器人肝癌细胞株SMMC-7721，α-amanitin(Fluka)、Cyclophosphamide (上海华联制药有限公司)、DMSO(Sigma)、MTT(Sigma)、胰蛋白酶(Gibco)、RPMI 1640培养液(Gibco)等。Model 680酶标仪(BIO-RAD)，BNA-311 CO2孵箱(ESPEC)等。
       1.2 方法
       1.2.1 细胞培养传代培养SMMC-7721细胞，于增殖生长旺盛期倾出其培养液，用生理盐水洗涤细胞3次，用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，用含10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞悬液，以约104细胞/孔接种于96孔培养板中，每孔体积200 μl。将培养板移入CO2孵箱中，在37℃，5.0%CO2条件下培养。
       1.2.2 α-amanitin作用浓度与细胞存活率的相关性细胞接种于96孔板中，按照作用药物分为两组，分别为α-amanitin实验组和CY组，每孔加入10 μl对应药物溶液，阴性对照组为生理盐水。α-amanitin终浓度分别为7.12×10-14，7.12×10-12，7.12×10-10，7.12×10-8，7.12×10-6，7.12×10-4 mmol/L，CY终浓度分别为2.5，5.0，10 mmol/L。每个药物浓度设置3个复孔，培养24 h后取出培养板，吸出培养液，加入150 μl无血清培养液，每孔加入10 μl MTT溶液，孵育4 h;孵育后取出培养板，1 000 r/min离心5 min，倾尽培养液，每孔吸出MTT溶液，加入50 μl DMSO，振荡15 min，用酶标仪在570 nm波长下测定光密度(OD570nm)，结果以±s表示，并计算细胞存活率(cell survival rate，CSR)。CSR计算公式为：CSR=(ODtest/ODcontrol)×l00%
       1.2.3 α-amanitin作用时间与细胞存活率的相关性α-amanitin实验组终浓度为7.12×10-4 mmol/L，CY组终浓度为10 mmol/L，阴性对照组为生理盐水。培养板置于37℃，5.0%CO2条件下培养0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h后取出，1 000 r/min离心5 min，换新鲜培养液200 μl，继续培养至距离初始添加处理药物24 h后再取出培养板，以后实验步骤同上，测OD570nm值，计算CSR。
       2 结果
       2.1 α-amanitin作用浓度对细胞存活率的影响不同浓度的α-amanitin和CY在对人肝癌细胞SMMC-7721作用24 h后的OD570nm测定值见表1～2，数据显示α-amanitin对SMMC-7721细胞株的增殖有显著抑制作用。7.12×10-4 mmol/L α-amanitin作用于体外培养细胞24 h后，SMMC-7721细胞存活率降到71.25%，作用效果与10 mmol/LCY相近;而7.12×10-10mmol/L α-amanitin的作用效果与2.5 mmol/L CY相近。表1 α-amanitin 浓度对SMMC-7721细胞株OD570nm的影响表2 CY浓度对SMMC-7721细胞株OD570nm的影响
       2.2 α-amanitin作用时间对细胞存活率的影响7.12×10-4 mmol/L α-amanitin和10 mmol/L CY作用于SMMC-7721细胞株0.5，1.0，2.0，4.0，8.0h后的OD570nm值见表3。数据显示，随着作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，α-amanitin作用SMMC-7721细胞株8h后，细胞CSR降至91.7%，对应时间的10 mmol/L CY组细胞株的CSR为和87.4%。表3 α-amanitin和CY作用时间对SMMC-7721细胞株OD570nm的影响
       2.3 α-amanitin对细胞毒性作用的数学模型拟合将α-amanitin浓度和细胞株CSR平方根分别做对数变换和反正弦变换，皮尔逊(Pearson)相关分析显示二者呈显著性相关。用曲线参数估计法(Curve Estimation)模块来拟合曲线，选择的曲线模型有线性模型(Linear)、二次曲线模型(Quadratic)、三次曲线(Cubic)、混合曲线(Compound)、生长曲线(Growth)、指数曲线(Exponential)等。由指数R2或ni=1(yi-^yi)2=min可见三次曲线方程Y=31.257 7-12.902X-1.511 7X2-0.0616X3最适于表达SMMC-7721细胞组应变量细胞存活率平方根的反正弦变换值对自变量α-amanitin浓度的对数变换值之间的回归关系。结果见表4。表4 α-amanitin浓度-SMMC-7721细胞株实验组多种曲线拟合结果
       随着α-amanitin作用时间的延长，细胞株的存活率呈单调性下降，作用时间与细胞株CSR平方根的反正弦变换值呈显著性相关。拟合曲线结果显示三次曲线模型方程Y=89.668 5-8.6166X+1.791X2-0.1271X3最适于表达SMMC-7721细胞组应变量细胞存活率平方根的反正弦变换值对自变量α-amanitin作用时间之间的回归关系。结果见表5。表5 α-amanitin作用时间-SMMC-7721细胞株实验组多种曲线拟合结果
       3 讨论
       α-amanitin浓度为7.12×10-10 mmol/L时，体外培养细胞SMMC-7721的OD570nm值由空白对照组的0.487±0.161降至0.426±0.051，细胞存活率为87.47%;当浓度为7.12×10-4mmol/L时，细胞存活率降低到71.25%。细胞株CSR平方根的反正弦值随α-amanitin浓度升高而降低，曲线拟合结果显示三次曲线方程Y=31.257 7-12.902X-1.5117X2-0.0616X3最适于表达体外培养SMMC-7721细胞组应变量细胞存活率平方根的反正弦变换值对自变量α-amanitin浓度的对数变换值之间的回归关系。
       CY在临床上使用剂量一般为200 mg/次，一疗程总量约为8～10g，折算成摩尔浓度约为7.17～8.96 mmol/L。α-amanitin对体外培养SMMC-7721细胞株的毒性作用与CY的作用相比，7.12×10-4 mmol/L α-amanitin作用24 h后，效果与10 mmol/L的CY相近，药品浓度相差1.4×104倍，说明单位摩尔数的α-amanitin对该体外培养细胞株的毒性作用显著强于单位摩尔数的CY。
       Hallen等[11]已经克隆到编码α-amanitin的基因AMA-1。Arima等[12]发现经α-amanitin抑制RNA聚合酶II转录活性，可以诱导p53在线粒体上的聚集和转位，从而启动依赖p53但不受转录影响的凋亡途径。Grna曾反复向氨基偶氮甲苯诱发的小鼠皮肤肿瘤注射极稀的α-amanitin，初次注射产生局部炎症，以后的注射使肿瘤坏死，紧接着损伤部位很快愈合。另外，α-amanitin受单克隆抗体Fab片段的作用能够提高毒性约50倍，而且其他amatoxins在特异性控制和肿瘤治疗方面也具有类似现象，Bermbach等将β-amanitin与表皮生长因子结合，该复合体主要进入肿瘤A431细胞，从而抑制A431细胞的生长，所以，设计将α-amanitin与其改造后的抗体结合，不仅可以降低α-amanitin的作用浓度，提高α-amanitin对细胞的作用效果，还能够改善它的靶向性。由此可见，研究α-amanitin作为针对于恶性增殖细胞的药物，在使用剂量和药品改良等方面具有很大的可塑性和广阔的应用前景。
       【参考文献】
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