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       【摘要】 
       目的探讨雪灵芝提取物对体外诱导肝细胞脂肪变性的影响。方法以人肝L-02细胞作为研究对象，用四环素建立肝细胞脂肪变性模型。将实验分为诱导组，继续诱导组、脱离诱导组，用油红O染色观察细胞形态和细胞内脂滴的形成情况，并测定细胞内甘油三酯(TG)含量的变化。结果雪灵芝提取物(20～60 μg·ml-1)可明显降低细胞内TG值，并呈剂量依赖性。结论雪灵芝提取物通过减少细胞内TG的生成从而阻止肝细胞脂肪变性。
       【关键词】  雪灵芝; 四环素; 甘油三酯
       Effects of Arenaria kansuensis Extracts (AKS) on Hepatocyte Steatosis Induced by Tetracycline in vitro
       DUAN Xiao-qun1, LIU Yong-ming1,LU Xi1,GONG Shou-ji1,CHEN Wei2
       (1. Department of Pharmacology, Guilin Medical College ,Guilin 541004,China;2.The Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of Arenaria kansuensis extracts (AKS) on hepatocyte steatosis induced by tetracycline in vitro.MethodsSteatosis model of hepatocytes established by adding tetracycline to the growing L-02 cell strain. Lipid droplets in the hepatocytes were observed by oil red staining and the content of triglyceride (TG) in hepatocytes was measured with analyzed kit. ResultsAKS(20～60μg·ml-1) concentration dependently decreased the level of TG in hepatocytes. ConclusionAKS can prevent hepatocyte fatty degeneration via inhibiting TG production.
       Key words：Arenaria kansuensis (AKS); Tetracycline; TG
       非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史(每周饮酒折合酒精量小于40 g)、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪储积为特征的临床病理综合征[1]。随着人民物质生活水平的提高，生活方式和饮食结构发生了显著的改变，再加上科学技术的飞跃发展，发现和被检测到的NAFLD患者逐年升高。由于NAFLD是肝硬化、肝癌的重要病因[2，3]，所以对其进行深入地研究具有十分重要的意义。
       雪灵芝(Arenaria kansuensis，AKS)系石竹科蚤缀属多年生草本植物，藏药名为阿仲嘎保，分布于西藏、青海、四川、甘肃，是一种极为宝贵的藏药资源，有悠久的药用历史[4]。以全草入药，性味甘寒，有清热解毒、利胆退黄、通淋止痛的作用，主治流感、黄疸、肺炎、筋骨疼痛、淋病等，还具有抗缺氧功效[5]和对酒精性肝损伤有保护作用[6]。本实验研究了雪灵芝提取物对四环素诱导的脂变细胞的影响，为进一步开发雪灵芝保健产品提供理论依据。
       1 材料与仪器
       1.1 仪器CO2培养箱(美国Forma scientificInc公司)，倒置显微镜(日本 Olympus公司)，酶联免疫检测仪Model-450(美国Bio-Rad公司)，旋转蒸发器(RE-52型，上海亚荣仪器厂生产)。
       1.2 试剂雪灵芝，由西藏阿仲嘎保生物制品有限公司提供;1640培养液购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;血清购自海克隆生物化学制品(北京)有限公司;四环素(实验室用)购自生工生物工程(上海)有限公司;油红O购自美国Sinma公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒购自美国Amersco公司;甘油三酯(TG)测定试剂盒购自浙江东欧生物工程有限公司。
       2 方法
       2.1 肝细胞培养人正常肝细胞株L-02，购自中国科学院上海生命科学研究所，用含10%胎牛血清1640培养基传代培养。
       2.2 雪灵芝提取物的制备将KAS全草粉碎，以6倍量的95%乙醇加热回流提取3次，1 h/次，合并提取液，浓缩干燥得AKS乙醇提取物。残渣挥干乙醇，用6倍量的蒸馏水加热回流提取3次，1h/次，合并提取液，浓缩干燥得AKS水提取物。
       2.3 四环素浓度的确定将处于对数生长期的L-02细胞调整浓度为5×104个/ml培养于96孔板中，分别加入不同浓度的四环素(见表1)，用MTT[7]比色法测定细胞增殖情况(以吸收度OD值表示)。结合细胞形态观察，选择对细胞活性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度作为诱导细胞形成脂肪变性的最佳浓度。
       2.4 雪灵芝提取物浓度的确定将处于对数生长期的L-02细胞调整浓度为5×104个/ml培养于96孔板中，分别加入不同浓度的雪灵芝提取物(见表2)，用MTT比色法测定细胞增殖情况(以吸收度OD值表示)。结合细胞形态观察，将对细胞活性影响小，不会导致细胞裂解死亡的浓度定为最高给药浓度。
       2.5 肝细胞脂变模型的建立将处于对数生长期的L-02细胞分为两组，即：对照组、诱导组，使每组细胞浓度均为5×104个/ml。对照组：用正常培养基培养;诱导组：每毫升正常培养基中加四环素12μg培养。在各实验条件下培养48h，收集细胞冻融液，严格按照TG试剂盒规定操作，测定其中TG的含量。制备油红O染色[8]标本，观察细胞脂滴数的变化。
       2.6 雪灵芝提取物对肝细胞脂变模型的影响将处于对数生长期的L-02细胞分为3组，使每组细胞浓度均为5×104个/ml。诱导组：损伤同时加药治疗48 h;继续诱导组：先损伤48 h，再在损伤的同时加药治疗48 h;脱离诱导组：先损伤48 h，再加药治疗48h。每组内均设有空白对照、模型、阳性对照及高、中、低3个剂量组，在各实验条件下收集细胞冻融液，严格按照TG试剂盒规定操作，测定其中TG的含量。用100μg·ml-1烟酸作为阳性对照药。
       2.7 数据处理所有数据均以±s表示，采用方差分析进行统计处理。
       3 结果
       3.1 四环素作用浓度的确定观察细胞形态发现，正常肝细胞为多边形，胞膜完整界限清楚，细胞浆丰富。四环素15 μg·ml-1组细胞数量与正常细胞相比基本不变，低倍镜下可见部分细胞形态有少许变化，但漂浮坏死细胞较少。30 μg·ml-1组细胞增大变圆，数量有减少。120 μg·ml-1组细胞多呈圆形或椭圆形，数量大大减少，细胞膜不完整，有破损(图1～3)。MTT实验检测结果提示：四环素浓度超过30 μg·ml-1时吸收度(OD值)下降明显，对细胞增殖影响力较大(表1)，再根据相关文献[9]报道，选择12 μg·ml-1作为四环素造模剂量。表1 MTT法检测四环素对肝细胞生长活性的影响(±
       3.2 雪灵芝提取物的浓度确定MTT检测结果提示(表2)，当AKS醇提物浓度超过80 μg·ml-1时，吸光度(OD值)下降明显，对细胞增殖影响较大，AKS水提物出现了浓度越高，细胞增殖能力及活性越强的特点。再结合预试结果，将雪灵芝提取物的实验浓度定为20，40，60 μg·ml-1。表2 MTT法检测雪灵芝提取物对肝细胞生长活性的影响
       3.3 油红O染色光学显微镜观察正常L-02细胞，细胞内仅可见点状散在红色脂肪滴(图4)，经12 μg·ml-1四环素离体诱导48 h后，细胞内出现大量聚集成颗粒状的红色脂肪滴(图5)。而正常L-02细胞经60 μg·ml-1雪灵芝提取物与12 μg·ml-1四环素共同培养48 h后，细胞内脂滴与模型细胞相比有所减少见图6～7。
       图4 正常细胞(100×) 图5 模型细胞(100×)
       图6 AKS水提物(100×) 图7 AKS醇提物(100×)
       3.4 肝细胞内TG含量的测定实验结果表明(见表2)，各组加四环素的模型细胞比不加任何药物的正常对照细胞胞浆内的TG值明显升高，加入烟酸的阳性对照细胞与模型细胞相比细胞内TG含量明显降低。
       各组给予雪灵芝提取物处理后，细胞内TG值均出现了明显的降低。继续诱导组细胞内TG值与模型细胞相比，差异明显(P<0.05)，脱离诱导组细胞内TG值降低最为明显，说明只要停止向培养液中加造模药，细胞内累积的甘油三酯可以自行降低，这与治疗脂肪肝首要在于去除病因的理论是一致的。AKS醇提物在3组实验中均表现出较好的降脂作用(高剂量与模型组比较，P<0.01)，且各剂量之间存在着一定的量效关系。AKS水提物在3组实验中，中剂量(40 μg·ml-1)的降脂作用强于高、低剂量组(P<0.01)。表3 AKS对脂变细胞TG含量的影响
       4 讨论
       本实验采用四环素制备肝细胞脂变模型，四环素属于抗生素类化学药物，该药脂溶性较好，具有肝毒性，能很好地渗透到大多数组织和体液中，且较易进入细胞内[10]。四环素引起脂肪肝的机制是抑制体内蛋白质的合成，特别是肝的载脂蛋白的合成，使肝内VLDL分泌发生障碍，从而不能使肝内TG运出肝细胞外，脂质以脂滴的形式聚于细胞内置网和高尔基复合体内。脂质及TG含量增加，肝脏脂质过氧化反应也增强，肝组织学检查显示，肝细胞产生明显的小泡性脂肪变性，符合非酒精性脂肪肝病理学研究结果[11]。其抑制蛋白质作用机制可能通过抑制肝细胞线粒体DNA复制或干扰DNA转录，使mRNA合成减少，从而使mRNA翻译成载脂蛋白的量减少。通过抑制肝内TG的转运及肝细胞线粒体对脂肪酸的β-氧化，从而诱发肝细胞脂肪变性。
       本实验将雪灵芝提取物作用于离体细胞模型，共分为3组：诱导组，损伤同时加药治疗2 d;继续诱导组，先损伤2d再在损伤同时加药治疗2 d;脱离诱导组，先损伤2d再加药治疗2 d。诱导组可以考察药物对脂肪肝的预防与减轻作用，继续诱导组和脱离诱导组可以考察有化学损伤因素存在或曾经服用肝毒性药物造成肝损害后，药物对肝细胞的治疗与保护作用。由脱离诱导组实验结果可知，一些高脂血症的患者不用马上服用降脂药，首先应该停止使用或接触具有肝毒性的化学物质，通过中药保健品或单纯饮食疗法即可获得痊愈。
       目前对NAFLD的治疗临床上多采用西药治疗，主要分为：HMG-COA还原酶抑制剂、胆汁酸螯合剂、苯氧芳酸类、烟酸类等。西药对于高脂血症患者具有起效快、作用强的特点，但这些药物对人体均有不同程度的毒副作用，长期服用经常会出现不良反应，而采用传统中药治疗脂肪肝，能有效防止并发症，减少由药物引起的不良反应，研究和开发降脂中药有良好的前景和重要的意义。
       雪灵芝中已经阐明结构的19种化合物大部分是脂溶性较高的[12]。其中三萜皂苷、环肽、生物碱(β-咔波啉)、阿魏酸被认为是雪灵芝中重要的活性成分。近年来，三萜皂苷、环肽类化合物在抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗菌等方面的作用，已引起了广泛的关注[13]。本实验对雪灵芝醇提和水提物进行了研究，认为雪灵芝醇提物具有明显的降低脂变肝细胞内甘油三酯的作用，进一步研究雪灵芝中的有效成分，可以开发出新的有价值的降脂药物。
       【参考文献】
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