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       【摘要】 
       目的研究灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同活性部位对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中尼古丁乙酰胆碱能受体 (Nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)蛋白水平的影响及其对抗β-淀粉样蛋白(Aβ) 细胞毒性的作用机制,以探讨其在阿尔茨海默氏病(Alzheimer"s disease，AD) 治疗中的作用。方法选用一定浓度的灯盏细辛不同部位及Aβ25～35处理SH-SY5Y细胞，用比色法测定培养细胞MTT还原率，蛋白质印迹法测定尼古丁受体α3亚单位蛋白水平。结果灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同部位中，经凝胶柱分离的第一区段、该区段经反相硅胶柱分离的低极性部位及乙酸乙酯萃取后再以正丁醇获得的萃取物，经凝胶柱分离的第四区段经反相硅胶柱分离出的低极性部位能上调SH-SY5Y细胞中α3nAChR 蛋白水平;同时能减弱Aβ25～35的细胞毒性作用。结论灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物分离部位可能是中药灯盏细辛的重要的活性部位，在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。
       【关键词】  灯盏细辛; 神经母细胞瘤细胞; α3尼古丁受体; β-淀粉样蛋白; 阿尔茨海默病
       Influence of the Active Parts Extracted from Herba Erigerontis on the Protein Level of α3 Nicitinic Receptor Subunit in Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells
       YAN Xiuming, DENG Jie，QI Xiaolan，HUANG Yong，WANG Yonglin，GUAN Zhizhong*
       (Department of Molecular Biology, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of the active parts extracted from Herba Erigerontis on the protein level of α3 nicitinic receptor subunit in human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells and against the neurotoxicity in SH-SY5Y cells induced by beta-amyloid peptide (A ). MethodsThe SH-SY5Y cells were treated by a certain safe concentration of the active parts extracted from Herba Erigeronitis, and exposed to Aβ25～35. MTT reduction was detected by photomatric assay, and the protein level of α3 nAChR subunit was detected by Western-blotting. ResultsThe active parts extracted from Herba Erigerontis stimulated upregulation of α3 nAChR protein in the cultured cells and prevented the MTT reduction resulted from Aβ. ConclusionThe active parts extracted from Herba Erigerontis may prevent neurotoxicity of Aβ by the upregulation of nAChR, which might play an important role in therapeutic strategy of AD.
       Key words： Herba Erigerontis; Neuroblastoma cells; α3 nicotinic receptor; β-amyloid peptide; Alzheimer disease
       阿尔茨海默氏病(Alzheimer"s disease，简称AD)是一种主要在老年期发生的以智力缓慢性进行性丧失为特征的神经变性疾病，是痴呆病中最常见的类型[1]。AD脑组织中典型的神经病理学改变是由β-淀粉样蛋白(β-myloid protein，Aβ)沉积形成的老年斑和高度磷酸化Tau蛋白聚集构成的神经原纤维缠结 [2]。Aβ在AD的病因学或病程发展中起关键作用,Aβ的神经毒性作用是造成AD神经退行性变的主要机理之一[3，4]。
       尼古丁乙酰胆碱能受体( nicotinic acetylcholine receptor，nAChR或称尼古丁受体)与学习和记忆等认知功能密切相关, 还调节多种其他受体的功能，并具有对抗神经细胞毒素性的神经保护作用[5]。在较早的一些研究中就发现，AD患者大脑皮层尼古丁受体出现持续和严重的丢失，大脑皮层nAChR缺失与AD患者认知障碍有显著的相关性[6]。
       由于AD的发病机制比较复杂，目前尚无有确切疗效的治疗药物。中草药在延缓衰老以及防治痴呆等相关疾病方面有着丰富的理论和实践经验，具有潜在的优势和广阔的发展前景。灯盏细辛是民间常用草药，其化学成分有灯盏乙素、黄酮、吡喃酮等十余种。灯盏细辛及其提取物可改善脑循环，增强急性缺血性脑卒中患者神经功能的恢复，对脑缺血具有明显保护作用，在治疗老年性疾病方面有着重要的作用。本研究以来源于人脑的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)作为研究对象,来研究灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同标本的神经保护作用机制，为进一步筛选其有效成分奠定理论基础。
       1 材料与试剂
       灯盏细辛活性部位由贵阳医学院提取并鉴定，灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物，经凝胶柱分离的第一区段标为D1号，将D1号样品经反相硅胶柱分离出高极性部位(标为D2号)，中极性部位(标为D3号)及低极性部位(标为D4号)。灯盏细辛乙醇提取，乙酸乙酯萃取后，再以正丁醇获得的萃取物，经凝胶柱分离的第四区段标号为D5。将D5号样品，经反相硅胶柱分离出高极性部位(标为D6)，中极性部位(D7)及低极性部位(D8)。
       D-MEM 培养液(英国Gibco Invitrogen 公司);源于人脑的SH-SY5Y细胞(德国German Col2 lection of Microorganisms and Cell Cultures公司);羊抗α3和鼠抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体及HRP标记的抗羊及抗鼠二抗(美国Santa Cruz Bio-technology Inc);聚乙烯二氟(PVDF) 膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片(Amersham公司);其他化学试剂均购自Sigma公司。
       2 方法
       2.1 细胞培养用含10%小牛血清、1%双抗(青霉素25 U/ml,链霉素25 U/ml)的DMEM作为培养基，5%CO2、饱和水汽、37℃恒温培养。
       2.2 3-4，5-二甲基噻唑-2，5-二酚四唑溴化物(3-(4 ，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dip hen-yltet razolium bromide，MTT)比色法筛查中药安全浓度 比色法测定MTT水平，测定波长为570 nm，常用来表示细胞的损伤程度和功能状况。
       向96孔细胞培养板中，加入一定数量(约1×104/孔)待检测细胞，加入灯盏细辛提取物，终浓度为：0，0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2 mg/ml，培养24 h后，测定细胞MTT还原率。
       2.3 细胞分组诱导及相应的药物干预先用含10%小牛血清的DMEM培养液培养SH-SY5Y细胞，待细胞生长稳定后,改用不含血清的DMEM培养液，继续培养12 h。为观察灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同部位对SH-SY5Y细胞α3尼古丁受体的影响，对SH-SY5Y细胞进行分组诱导。每个实验组均设3个复孔,重复3次实验。
       对照组：不经药物处理，培养期为48 h。
       Aβ处理组：在培养的细胞中加入10 μmol/L Aβ25～35，培养时间为48 h(细胞培养前将Aβ25～35用PBS溶解后，37℃孵育72 h，以保证获得有毒性作用的聚集性Aβ)。
       尼古丁处理组：加入50 μmol/L尼古丁，培养期为24 h。
       中药处理组：分别加入不同标本培养24 h。
       中药和Aβ处理组：先分别加入不同标本培养24 h，再按照Aβ处理组的方法处理。
       2.4 中药和Aβ处理后MTT测定向96孔细胞培养板中，加入一定数量(约1×104/孔)待检测细胞，选择能够上调α3 nAChR蛋白水平的药物分组处理细胞，测定MTT水平。
       2.5 尼古丁受体亚单位蛋白表达测定参照Guan等的方法进行提取细胞膜蛋白及用西印迹方法检测 α3 nAChR蛋白水平。以Labworks软件分析结果时以β-actin蛋白条带作为内参照，计算α3 nAChR蛋白条带与β-actin蛋白条带像素灰度的百分比值作为α3 nAChR蛋白表达的相对水平比。
       2.6 统计学分析　每组所得结果用±s表示,结果用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析。
       3 结果
       3.1 灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同部位安全浓度筛查灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同部位质量浓度在0.025～2 mg/ml范围处理细胞时，大于0.5 mg/ml时SH-SY5Y神经细胞MTT还原率出现明显变化，在0.025～0.5 mg/ml范围时细胞MTT还原率无明显变化，表明该浓度对细胞毒性作用较小。本实验以0.5 mg/ml作为研究灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物8个部位的选用浓度。
       3.2 尼古丁乙酰胆碱受体亚单位蛋白水平尼古丁乙酰胆碱受体α3亚单位蛋白水平结果表明，单纯灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物8个部位以0.5 mg/ml浓度处理细胞时，D1、D4、D8标本处理细胞可上调 α3 nAChR 亚单位蛋白水平，D3、D5标本处理细胞下调α3nAChR亚单位蛋白水平，D2、D6、D7标本处理细胞不影响α3nAChR亚单位蛋白水平;50 μmol/L尼古丁处理细胞可上调α3nAChR亚单位蛋白水平;D4号标本上调α3nAChR亚单位蛋白水平的作用明显强于尼古丁上调α3nAChR亚单位蛋白水平作用;对照组与单纯中药处理组之间的差异有统计学意义。见图1。
       细胞分组及相应的药物处理后，用Western blotting 法测定SHSY-5Y神经细胞α3nAChR蛋白水平，结果用单因素方差分析法统计分析(n=6)，a表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，b表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Con：对照组;Nic：尼古丁处理组;D1～D8：灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同标本处理组
       图1 SHSY-5Y神经细胞药物处理后α3nAChR蛋白水平
       3.3 灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物处理后MTT还原率选用能上调α3nAChR亚单位蛋白水平的D1，D4、D8标本分组处理细胞，测定MTT水平。MTT还原率测定发现，10 μmol/L Aβ25～35处理细胞后引起MTT还原率明显降低;0.5 mg/ml灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物D1、D4、D8标本预处理细胞后，可明显减弱Aβ25-35对细胞的毒性作用;Aβ组与中药+Aβ组之间的差异有统计学意义。结果见图2。
       细胞分组及相应的药物处理后，测定SHSY-5Y神经细胞MTT还原率，结果用单因素方差分析法统计分析(n=6)，a表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，b表示与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05), c表示与Aβ组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Con：对照组;Aβ：Aβ处理组;D1、D4、D8：灯盏细辛醇提物乙酸乙酯萃取物不同部位处理组。D1+ Aβ、D4+ Aβ、D8+ Aβ：灯盏细辛醇提物乙酸乙酯萃取物不同部位和Aβ处理组
       图2 SHSY-5Y神经细胞药物处理后MTT还原率
       4 讨论
       在AD患者脑组织中老年斑的主要成分Aβ具有一定的神经毒性作用。研究表明Aβ是由β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶参与的β裂解过程产生的[7]。Aβ由39～43个氨基酸构成，其中25～35的氨基酸序列是神经毒性必需结构。Aβ的损伤作用是AD发生发展的首要因素,其损伤机制是通过增强氧化应激反应和释放自由基产物而引起神经元受损。本研究用Aβ25～35处理来源于人脑的SH-SY5Y神经细胞,模拟AD患者脑内神经细胞的病理过程，以此作为灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物8个部位体外研究的类AD细胞模型。
       烟碱型乙酰胆碱受体是神经系统中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通道,与学习和记忆关系密切,是一类明确的具有神经保护功能的受体,其减少与AD的发生有关[8]。AD患者脑内烟碱型乙酰胆碱受体-配体结合率降低,其亚基的蛋白水平也降低[9]。在SH-SY5Y神经细胞中,α3和α7是主要的尼古丁受体亚类。本研究中, 通过测定α3nAChR亚单位蛋白水平发现,灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物8个部位中，D1，D4，D8号标本能上调α3 nAChR亚单位蛋白水平，并且D4号标本上调α3nAChR亚单位蛋白水平的作用明显强于尼古丁的上调作用。
       在治疗AD的药物中，选择能上调尼古丁受体的蛋白水平且副作用小的药物是方向之一。本实验选用能上调α3nAChR亚单位蛋白水平的D1，D4、D8进行MTT水平测定。研究结果也显示,与对照组相比,Aβ25～35处理组SH-SY5Y神经细胞的MTT还原率明显降低,进一步证实Aβ25～35可通过其毒性机制损伤神经细胞。灯盏细辛醇提物乙醇乙酯萃取物分离部位D1，D4，D8号样品预处理的SH-SY5Y细胞能够对抗Aβ25～35引起的MTT还原率降低,表明 D1，D4，D8号标本具有抗Aβ25～35引起的细胞毒性的作用，
       尼古丁可以明显抑制Aβ的细胞毒性。动物试验发现，Aβ可以明显减少乙酰胆碱的释放，从而损伤动物的认知功能，尼古丁处理可以明显保护Aβ的损伤作用。研究还发现，尼古丁可能通过抑制Aβ从α螺旋到β折叠构象的的转换从而抑制Aβ的聚集，还有可能通过增强α分泌酶的活性,使细胞可溶性APP释放增加，而减少Aβ的生成[10]。尼古丁作为nAChR的激动剂，能诱导大脑中nAChR的功能上调,使胆碱能系统的功能维持在正常水平。本实验结果亦显示尼古丁能上调α3 nAChR亚单位蛋白水平，且尼古丁预处理的SH-SY5Y细胞能够对抗Aβ25～35引起的MTT还原率降低。灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物分离部位中，经凝胶柱分离的第一区段，该区段经反相硅胶柱分离的低极性部位及乙酸乙酯萃取后再以正丁醇获得的萃取物，经凝胶柱分离的第四区段经反相硅胶柱分离出的低极性部位能上调细胞α3 nAChR的蛋白水平，又能对抗Aβ的细胞毒性作用。其中以灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物经凝胶柱分离的第一区段经反相硅胶柱分离的低极性部位上调α3nAChR亚单位蛋白水平的作用明显强于尼古丁的上调作用。其作用机制和尼古丁的神经保护机制可能不完全相同，具体机制有待进一步研究。
       综上所述，灯盏细辛醇提物乙酸乙酯萃取物活性部位既能上调α3 nAChR的蛋白水平，又能对抗Aβ的细胞毒性作用，在AD的中药治疗中可能具有重要作用。灯盏细辛活性部位对Aβ诱导神经细胞损伤的保护作用可能与其上调细胞尼古丁受体水平有关，在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。
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