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       【摘要】 
       目的研究肾阳虚状态下血管升压素-环磷酸腺苷-水通道蛋白2(AVP-cAMP-AQP2)信号途径的功能变化，探讨肾主水的现代医学机制。方法20只成年雄性SD大鼠分为对照组和模型组。主要采用放免法测定血AVP和肾髓质cAMP水平、免疫组化技术检测集合管AQP2表达。结果与对照组相比，模型组大鼠的尿量明显增加，血AVP和肾髓质cAMP水平下降，集合管上皮细胞AQP2表达减少。结论肾阳虚时AVP-cAMP-AQP2信号途径功能下降。
       【关键词】  肾阳虚; 血管升压素; 水通道蛋白2
       Relationship of Kidney-"yang" Deficiency and AVP-cAMP-AQP2 Signal Path
       SHAN Dehong, YU Huaxin, WANG Deshan
       (Fundamental Medical College, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China)
       Abstract：ObjectiveTo detect the modern medical mechanism of Kidney-yang deficiency by researching the function of AVP-cAMP-AQP2 in Kidney-"yang" Deficiency.Methods20 male adult SD rats were randomly divided into control and model groups. Radioimmunoassay was employed to detect the AVP and cAMP levels, and immunohistochemistry was applied to measure AQP2 expression in collecting ducts.ResultsCompared with those in the control, urine volume was decreased markedly, plasma AVP and cAMP levels in renal medullar tissue were decreased obviously, and AQP2 expression was decreased significantly in model group.ConclusionThe function of AVP-cAMP-AQP2 pathway decreases in Kidney-"yang" deficiency.
       Key words：Kidney-"yang" deficiency; Vasopressin; AQP2
       中医理论认为肾主水，可以通过控制尿量来维持津液代谢的平衡。这与现代医学中的尿液浓缩和稀释机制极为相似。现代医学认为，尿液的浓缩与稀释主要完成于肾髓质，受下丘脑合成分泌的血管升压素(AVP)调节。AVP作用于集合管上皮细胞V2的受体，通过cAMP调节水通道蛋白2(AQP2)表达，最终影响水的重吸收。目前肾主水与尿液浓缩和稀释机制的关系研究较少。本项工作主要探讨肾阳虚与AVP-cAMP-AQP2信号途径的关系，从而揭示肾主水的现代医学机制。
       1 材料与方法
       1.1 动物分组成年雄性SD大鼠20只(购于中国医科大学动物室)，(220±24)g。所有动物适应性饲养1周后，随机分为对照组、肾阳虚模型组(模型组)，每组10只。室温(22±1)℃，自由饮水、进食。
       1.2 肾阳虚模型的复制方法参考杜卉莲等[1]的方法进行模型制备，模型组大鼠每日上午按200 mg·kg-1·d-1腺嘌呤(北京思语伟业生物技术有限公司)灌服，对照组只给予灌胃刺激，共21d。
       1.3 尿量及尿渗透压检测造模结束后，将大鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，再利用冰点渗透压计(广州巿中璐仪器有限公司，Osmo 16S)检测渗透压。
       1.4 血浆AVP和肾髓质cAMP检测大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.4ml/100g)麻醉后，按试剂盒说明书经腹主动脉取血和肾髓质组织匀浆，采用放免法检测。AVP试剂盒(批号：20071005)和cAMP放免试剂盒(批号：20071027)均购于中国人民解放军解放军总医院放免研究所。此项工作由沈阳202医院内分泌室完成。
       1.5 大鼠肾髓质AQP2表达SABC法。从麻醉大鼠的升主动脉快速注入150 ml生理盐水，冲去血液，取双侧肾脏髓质，4%多聚甲醛固定4h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，厚度4 μm。取切片常规脱蜡至水，置于3%H2O2(室温10 min)，蒸馏水洗3次;切片浸入0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液(pH6.0)，加热至沸腾，间隔5 min后再加热至沸腾，室温冷却后用0.1 mol/L PBS(pH7.3)洗涤2次;滴加抗原修复液I(室温20 min)，0.1 mol/L PBS(pH7.3)洗涤2次;滴加正常山羊血清封闭液(室温20 min)，甩去多余液体，不洗;滴加羊抗兔AQP2一抗(1∶400稀释)，4℃过夜，0.1 mol/L PBS(pH7.3)洗涤2次，每次5 min;滴加生物素化羊抗兔IgG(室温25 min)，0.1 mol/L PBS(pH7.3)洗涤2次，每次5 min;滴加试剂SABC(室温25 min)，0.1 mol/L PBS(pH7.3)洗涤2次，每次5 min;DAB显色，苏木素轻度复染，约30s，自来水水洗，1%盐酸酒精稍分色后兰化片刻;常规脱水、透明、中性树胶封片。阴性对照用PBS缓冲液替代一抗。利用BI-2000医学图像分析系统检测AQP2的光密度值。
       1.6 统计学方法数据以±s表示，应用SPSS13.0进行统计处理，采用ANOVA检验，P<0.05为有显著性差异。
       2 结果
       实验过程中没有大鼠死亡和脱失。模型组大鼠出现畏寒肢冷、蜷缩拱背、多尿、活动减少、体毛枯疏、无光泽等表现。AQP2表达为棕黄色颗粒，位于集合管上皮细胞胞膜和胞浆处。相关检测数据见表1。
       3 讨论
       中医理论认为肾主水，主宰机体的津液代谢，特别对于尿的生成和排出有直接作用。肾阳虚常伴有阳虚水泛的表现，如形寒肢冷、水肿、小便清长、尿量增加等表现。本实验观察到模型组大鼠出现畏寒肢冷、蜷缩拱背、多尿等现象，表明肾阳虚模型大鼠出现了阳虚水泛的症状。中医所说的阳虚水泛与现代医学中的体液增多较为相似。现代医学认为体液过多时，机体会启动尿液稀释机制进行代偿，即下丘脑的视上核和室旁核合成和分泌AVP减少，降低肾脏集合管对水的通透性，从而减少水的重吸收，使尿液稀释，尿量增加。上述过程是否也发生于肾阳虚状态下，目前还未报道。本研究对此进行了初步探讨。表1 各组大鼠尿量、尿渗透压、血浆AVP、肾髓质cAMP和AQP2表达情况(±s)与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01;n=10
       实验中观察到模型组大鼠的尿量明显增加、尿渗透压显著下降，说明肾阳虚大鼠的排水量出现了增加。作为机体排水的主要途径，尿量受神经内分泌调节，其中下丘脑起关键作用。当机体水液过多时，可通过许多途径抑制下丘脑合成和分泌AVP。实验中检测到模型组大鼠的血浆AVP水平下降，表明肾阳虚大鼠的下丘脑合成和分泌AVP减少。AVP又称抗利尿激素，可被血液运到肾脏，作用于集合管上皮细胞膜上的V2受体，再通过兴奋性G蛋白与膜内的腺苷酸环化酶相耦联，提高cAMP水平，cAMP再激活蛋白激酶A，促使含水通道蛋白的胞浆小泡以胞吐的方式将水通道蛋白插入到集合管上皮细胞顶端膜，增加水通道蛋白表达，从而提高了管腔膜对水的通透性。在上述途径中，cAMP和水通道蛋白是AVP发挥作用的关键环节。cAMP是第二信使，在跨膜细胞转导中起细胞内信息传递作用。本实验中虽未能检测胞内cAMP水平，但其在肾髓质中的含量明显下降，提示肾阳虚大鼠的cAMP水平减少，其变化与AVP一致。AQP2是集合管上皮细胞上最重要且受AVP调节的水通道蛋白。实验中观察到模型组大鼠的AQP2光密度值明显低于对照组，表明肾阳虚状态下AQP2表达减少，这与AVP和cAMP变化相一致。
       综合以上实验结果和分析，本研究认为，肾阳虚时出现的水湿停滞现象与现代医学的AVP-cAMP-AQP2信号转导途径有关，即下丘脑合成分泌AVP减少，集合管上皮细胞内的cAMP水平下降，导致集合管上的AQP2表达减少，从而限制了水的重吸收，最终出现尿量增加的现象。由此推测肾主水功能与现代医学中肾脏对尿液的浓缩稀释机制密切相关。
       【参考文献】
         　[1] 杜卉莲,傅晓晴.慢性肾衰动物的模型制备及临床应用[J].中医研究，2005,18(12)：53.