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       【摘要】 
       目的研究树舌多糖(Ganoderma applanatum polysaccharides,GAPS)粗提物对人胃粘液性腺癌MGC-803细胞增殖、细胞周期及其对受体蛋白酪氨酸激酶EGFR表达的影响，探讨树舌多糖抗肿瘤作用机制。方法MTT法检测不同时间不同浓度树舌多糖对胃癌细胞MGC-803增殖抑制作用;流式细胞仪检测2.0 g/L树舌多糖作用72 h后MGC-803细胞的周期分布，流式细胞仪检测和免疫荧光显微镜观察树舌多糖对MGC-803细胞EGFR表达的影响。结果树舌多糖对胃癌细胞MGC-803具有增殖抑制作用，并呈时间及浓度依赖性。2.0 g/L树舌多糖作用72 h后，MGC-803细胞被阻滞于G0/G1期，S期和G2/M期细胞减少，与细胞对照组比较有差异，具有统计学意义(P<0.05)。荧光显微镜下观察树舌多糖组MGC-803细胞EGFR荧光强度较对照组明显减弱;流式细胞仪检测树舌多糖能下调MGC-803细胞EGFR表达，与细胞对照组比较有差异，具有统计学意义(P<0.05)。结论树舌多糖可以抑制胃癌MGC-803细胞的增殖，这与树舌多糖能够阻止肿瘤细胞由G1期进入S期、延缓细胞周期进程，降低受体型酪氨酸蛋白激酶EGFR的表达、阻断细胞增殖信号转导途径的信息传递有关。
       【关键词】  树舌多糖; MGC-803细胞; 增殖; 细胞周期
       Effects of GAPS on Gastric Cancer Cell Line MGC-803 Proliferation and EGFR Expression
       LI Ronghui1， WANG Yu2， ZHENG Lihong2， ZHANG Chunjing2， XU Huiyu2， ZHANG Yingbo2， PAN Hongming2*
       (1. Basic Medical College, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. Basic Medical College, Qiqihaer Medical College, Qiqihaer 161006, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of crude polysaccharide extracted from Ganoderma applanatum (GAPS) on proliferation, cell cycle and EGFR expression of human gastric cancer cell line MGC-803 and its possible mechanisms. MethodsMTT assay was used to investigate the inhibitory effect of GAPS on MGC-803 which was treated with different concentration of GAPS for 24 , 48 and 72 h. Cell cycle and expression of EGFR were analyzed by flow cytometry (FCM). The fluorescence intensity of EGFR expression in MGC-803 cells was observed by fluorescence microscope. ResultsGAPS inhibited the proliferation of MGC-803 cells in dose-dependent and time-dependent manners. After MGC-803 cells were treated with 2.0 g/L GAPS for 72 h, cell cycle was arrested at G0/G1 phase with statistic significance of difference compared with control group (P<0.05) . The fluorescence intensity of EGFR expression in GAPS treated group cells was weakened which consistanted with the results of FCW that GAPS can decrease the expression of EGFR in MGC-803 cells with statistic significance difference compared with control group (P<0.05) .ConclusionGAPS can inhibit the proliferation of gastric carcinoma MGC-803 cells and prevent cell cycle from stepping down proceeding, arresting at G0/G1 phase ;GAPS can decrease the expression of EGFR so that it can inhibit MGC-803 proliferation by blocking information transmission of cell proliferation signal transduction pathway.
       Key words： GAPS; MGC-803 cell ; Proliferation; Cell cycle
       树舌Ganoderma applanatum又称“老牛肝”“扁芝”或“扁木灵芝”，是一种大型担子菌，灵芝科植物树舌灵芝的干燥子实体。我国大部分地区均有分布，生长在阔叶树树干上或根部，其性平，味微苦，具有清热、止痛、化积、止血、化痰、抗癌等功效。国内学者对树舌多糖抗肿瘤作用的实验研究，从增加宿主免疫功能到对肿瘤细胞的直接作用、对癌基因,抑癌基因的调控以及对蛋白质组表达的影响等研究[1～7]。本实验通过树舌多糖作用于体外培养胃癌细胞MGC-803，观察其对胃癌细胞增殖和EGFR表达的影响及探讨机制。
       1 材料与仪器
       1.1 细胞株胃癌MGC-803细胞购于中国科学院上海生命科学研究院,细胞以1×105/ml接种于培养瓶中，加入含有10%灭活的胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养液，置于37℃恒温，5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3 d传代1次。当细胞长到80%时传代，用0.25%胰蛋白酶消化，弃去胰酶，加入新鲜培养基吹打均匀，按1∶3传代。
       1.2 药物树舌多糖(含量30%)购于哈尔滨乐泰药业有限公司岔林河中药提取厂。按照文献[8]醇沉和去蛋白得到实验所用的树舌粗多糖。PBS溶解配成浓度为40 g/L原液，微孔滤膜滤过除菌，4℃冰箱保存，用时将完全培养基稀释到所需浓度。
       1.3 试剂RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品;标准胎牛血清为天津灏洋生物制品科技有限责任公司产品;DMSO、MTT为美国Amresco公司产品;细胞周期染色溶液为北京联科公司产品;FITC-EGF Receptor为美国BD产品。
       1.4 仪器酶联免疫检测仪(5082型)奥地利TECAN公司;流式细胞仪(FACS Calibur)美国BD公司;荧光显微镜为日本Olympus
       2 方法
       2.1 树舌多糖对胃癌细胞增殖的影响取对数生长期细胞离心后,调整细胞浓度为5×104个/ml，200 μl/孔接种于96孔培养板中，共加3块板，培养24 h。实验设空白组(完全培养基)、细胞对照组和多糖处理组(终浓度为0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 g/L)。分别培养24，48，72 h。实验终止前4 h加5 mg/ml MTT 20 μl/孔，4 h后弃上清液。每孔再加入DMSO 150 μl，振荡器充分振荡10 min后，以空白组调零，在酶联免疫检测仪波长570 nm处，测定各组吸光度值(OD值)并计算增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。实验重复3次。
       2.2 树舌多糖对细胞周期分布的影响 培养72 h后，收集细胞无水乙醇中固定 10 min，避光孵育30 min,流式细胞仪上机检测细胞周期，实验重复3次。
       2.3 树舌多糖对EGFR表达影响
       2.3.1 流式细胞仪检测EGFR表达培养72 h后，收集细胞，2%多聚甲醛2 ml 37℃固定10 min,孵育30 min。洗涤细胞，封闭10 min，加10 μl抗体，室温避光30 min，去上清，加0.5 ml PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测，实验重复3次。
       2.3.2 荧光显微镜观察EGFR的表达把处于对数生长期的细胞培养24 h。按细胞对照组和树舌多糖组，分别加入完全培养基和2.0 g/L树舌多糖，培养72 h。PBS冲洗，加入无水乙醇，固定20 min，封闭30 min。按1∶50稀释抗体，孵育1 h，荧光显微镜下观察，照相。
       2.3.3 统计学分析SPSS13.0统计软件进行统计学处理，采用t检验，所有数据以 ±s表示，P<0.05表示差异有统计学意义。
       3 结果
       3.1 树舌多糖对MGC-803细胞增殖抑制作用MTT检测结果显示树舌多糖抑制MGC-803细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性，即随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制作用明显加强。2.0 g/L树舌多糖作用72 h后对MGC-803抑制率为45.2%。结果见图1。
       图1 树舌多糖对MGC-803细胞增殖抑制曲线
       3.2 树舌多糖对细胞周期分布的影响MGC-803细胞在2.0 g/L树舌多糖作用72 h后，收集细胞上流式细胞仪并检测分析细胞周期分布，经ModFit LT for macv3.0软件分析结果：树舌多糖使MGC-803细胞的G0/G1期细胞比例有所增加，而S、G2/M期细胞比例下降，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1及图2。表1 树舌多糖对MGC-803细胞周期的影响
       3.3 树舌多糖对MGC-803细胞EGFR表达的影响 2.0 g/L树舌多糖作用72 h后，荧光显微镜及流式细胞仪结果显示树舌多糖组荧光强度较细胞对照组明显减弱，即EGFR表达减少。结果见图3～4。
       4 讨论
       MTT法检测树舌多糖对人胃癌MGC-803细胞增殖抑制作用，根据绘制细胞增殖抑制曲线来看树舌多糖可抑制MGC-803细胞生长且具有明显的时效和量效关系，即浓度越大，作用时间越长，抑制作用也就越强。2.0 g/L树舌多糖作用72 h后对MGC-803抑制率为45.2%。根据以上实验结果采用其中一个作用点，72 ，2.0 g/L树舌多糖作为本实验的作用时间和浓度。
       肿瘤是一类渐进性细胞周期调控机理破坏的疾病[9]。应用流式细胞仪检测MGC-803细胞周期分布结果显示，树舌多糖组G0/G1期、S期、G2/M期比例有所增加，S期、G2/M期细胞比例减少，表明树舌多糖抑制MGC-803细胞增殖主要是通过阻止肿瘤细胞由G1期进入S期，防止其损伤的碱基被复制;使进入S和G2/M期细胞减少，延缓细胞周期进程，使细胞的增殖速递减慢，抑制肿瘤细胞的增殖。
       表皮生长因子受体( EGFR)是常见的受体型蛋白酪氨酸激酶(PTK)，PTK的异常活化也可能激活Ras信号通路。EGFR基因在许多上皮来源的肿瘤组织中呈现表达或有过表达的改变[10，11]。有研究表明[12]，EGFR在胃癌组织中的阳性表达率较高，与胃癌的浸润、转移及预后密切相关。本实验对EGFR的表达进行检测，实验结果显示树舌多糖可以使MGC-803细胞对EGFR的表达水平降低，用两种不同的检测手段(免疫荧光显微镜和流式细胞仪)结果一致。在荧光显微镜镜下及流式细胞仪检测显示树舌多糖可以下调EGFR表达，作用于信号转导途径的上游激酶，阻断增殖信息的传递，从而抑制细胞的增殖。
       综上所述，树舌多糖可以抑制胃癌MGC-803细胞的增殖，这可能与树舌多糖阻止肿瘤细胞由G1期进入S期、延缓细胞周期进程，降低受体型酪氨酸蛋白激酶EGFR的表达，从而阻断细胞增殖信号转导途径的信息传递有关。
       【参考文献】
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