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       【摘要】 
       目的建立独一味中四种环烯醚萜苷的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱Waters Symmetry(3.5 μm，3.5 mm×100 mm)，柱温：25℃，流动相为甲醇-水梯度洗脱(0～8 min，12%～15%;8～11 min，15%～27%;11～15 min，27%;15～18 min，27～40%;18～25 min，40%～48%;25～27min，60%甲醇)，流速1.0ml/min，检测波长235 nm。结果Sesamoside在0.236～1.18 μg、Shanzhiside methylester在0.440～2.20 μg，7,8-dehydropenstemoside在0.094～0.470 μg，8-O-acetylshanzhiside methyl ester在0.750～3.75 μg的浓度范围内线性关系良好，回收率均在96%～104%之间，RSD均小于5%。结论此方法准确可靠，重复性好，结果稳定，可作为该产品质量控制的方法。
       【关键词】  独一味; 高效液相色谱; 环烯醚萜苷
       独一味Lamiophlomis rotata(Benth.) Kudo为唇形科植物，以全草或根及根茎入药，是藏、蒙、纳西族等少数民族常用草药，生长于海拔3 000 m以上的石质高山草甸、河滩地，分布于甘肃、青海、西藏、四川等藏区，具有止血、镇痛消肿、活血化瘀、续筋接骨等功效[1]。以独一味开发出的国家新药独一味胶囊临床用于治疗骨外伤、术后疼痛、妇科疾病等取得了满意的疗效。《中国药典》[2](2005年版Ⅰ部)仅收载木犀草素做对照，以HPLC测定了独一味及胶囊中的含量[3]，而研究表明独一味总环烯醚萜苷类成分具有很好的止血、 促凝血作用，是其中的止血活性成分[4，5]。为了更有效地控制独一味的质量，本实验采用高效液相色谱梯度洗脱法同时测定了四种环烯醚萜苷成分的含量，以确保产品质量。本实验建立的测定方法准确可靠，重复性好，灵敏度高。
       1 仪器与材料
       Waters1525高效液相液谱仪，2996PDA检测器，717SAMPLER自动进样器，MILLIQ纯水机，BCHI旋转蒸发仪，Sartorius CP224S电子天平 Max 220 g，d 0.1 mg。
       独一味药材[药材市场购买，由刘毅副教授鉴定为唇形科植物独一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo.的干燥根];对照品Sesamoside(纯度99.87%)，Shanzhiside methylester(纯度99.01%)，7,8-dehydropenstemoside(纯度98.25%)，8-O-acetylshanzhiside methyl ester(纯度98.63%)均为本实验自制，核磁共振检测;甲醇为色谱纯 (Scharlau　chemie　S.A.)，其余试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件色谱柱：Waters Symmetry柱(3.5 μm，3.5 mm×100 mm)，柱温：25℃，流动相为甲醇-水梯度洗脱(0～8 min，12%～15%;8～11 min，15%～27%;11～15 min，27%;15～18 min，27%～40%;18～25 min，40%～48%;25～27 min，60%甲醇)，流速1.0 ml/min，检测波长235 nm。
       2.2 系统适应性及专属性实验分别取对照品溶液、供试品溶液各5μl进样，记录色谱图见图1～2。在上述色谱条件下Sesamoside出峰时间为3.527 min，Shanzhiside methylester 出峰时间为6.605 min，7,8-dehydropenstemoside出峰时间为14.459 min，8-O-acetylshanzhiside methyl ester出峰时间为19.775 min。供试品在相应位置有显著峰。以Shanzhiside methylester计，理论塔板数>1 500，两峰的分离度≥1.5。实验结果表明该方法能使独一味环烯醚萜苷较好分离，色谱系统的适应性及专属性良好。
       图1 对照品的HPLC图谱
       图2 独一味药材的HPLC图谱
       2.3 标准曲线的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetylshanzhiside methyl ester对照品，加甲醇制成每毫升含Sesamoside 0.472mg，Shanzhiside methylester 0.880mg，7,8-dehydro- penstemoside 0.188mg，8-O-acetylshanzhiside methyl ester1.50 mg的混合标准溶液。
       精密量取上述对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml，分别置于6个5.0 ml量瓶里，甲醇定容，即得对照品溶 液。分别进样5 μl，以峰面积为纵坐标，以进样量为横纵坐标进行线性回归，得各成分回归方程见表1。表1 4种成分的回归方程
       methyl esterY=-7.37×104+1.41×106X0.999 60.750～3.75
       2.4 供试品溶液的制备独一味药材研细，过60目筛，精密称取细粉0.5g，置25 ml具塞锥形瓶中，加70%甲醇25 ml，称定重量，超声20 min，冷却，用甲醇补充重量，过滤，精密吸取续滤液1.0 ml，至5 ml容量瓶中，70%甲醇定容，摇匀;用0.22 μm微孔滤膜滤过即得。
       2.5 仪器精密度实验取供试品溶液，连续进样6次，10 μl/次，记录峰面积，结果Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetyl- shanzhiside methyl ester峰面积的RSD分别为1.53%，3.25%，2.76%，1.97%，表示精密度良好。
       2.6 稳定性实验取供试品溶液于0，2，4，6，8，10 h进样分析，每次10 μl，记录峰面积，结果Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetylshanzhiside methyl ester峰面积的RSD分别为3.61%，1.20%，2.01%，3.37%。结果表明供试品溶液中Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetylshanzhiside methyl ester在10h内稳定。
       2.7 重复性实验取同一批独一味，按照“2.4”项下方法制备6份样品液，分别测定峰面积，结果Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetylshanzhiside methyl ester的RSD分别为2.75%，3.86%，3.24%，2.66%。
       2.8 加样回收率实验精密吸取已知含量的独一味样品，6份，分别精密加入Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetylshanzhi- side methyl ester混合对照品溶液适量，按照“2.4”项下方法制备样品液，进样10 μl测定峰面积，结果Sesamoside、Shanzhiside methylester、7,8-dehydropenstemoside、8-O-acetylshanzhiside methyl ester的平均回收率分别为96.75%，103.21%，103.77%，99.85%，RSD分别为2.86%，3.68%，2.77%，1.55%。
       2.9 样品含量测定 取独一味样品，按上述“2.4”方法制备样品溶液，分别精密吸取10 μl供试品溶液， 注入液相色谱仪， 测定峰面积积分值，用外标法测定样品中环烯醚萜苷的含量。3批药材的测定结果见表2。表2 独一味中Sesamoside, Shanzhiside methylester，7，8-Dehydropenstemoside, 8-O-Acetylshanzhiside methyl ester的测定结果
       3 结论
       研究表明独一味总环烯醚萜苷类成分具有很好的止血、 促凝血作用，是其中的止血活性成分[3]，本研究采用RP-HPLC法对独一味药材中的Sesamoside，Shanzhiside methylester，7,8-Dehydropenstemoside，8-O-Acetylshanzhiside methyl ester 4个环烯醚萜苷进行定量测定，对独一味药材具有更切实际的指导意义。
       试验时考察了乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸水、 甲醇-水、 甲醇-0.4%磷酸水 4种流动相，并尝试了这4种流动相的多种线性梯度洗脱，结果表明甲醇-水系统最佳，并进行了梯度洗脱条件的优化。采用该系统各个色谱峰的峰形和分离度都较好，基线稳定。因此选用该系统为独一味药材含量测定的流动相。
       此方法准确可靠，重复性好，结果稳定，可作为该药材质量控制的方法。
       【参考文献】
         　[1] 张 凤，孙连娜，陈万生.独一味的化学成分及药理作用[J].药学实践杂志，2008，26(3)：169.
       
       [2] 国家药典委员会.中国药典[S].北京：化学出版社，2005：184.
       
       [3] 贾正平，李茂星，张汝学，等.独一味止血有效部位的实验研究[J].解放军药学学报，2005，21(4)：272.
       
       [4] 马 潇，丁永辉，徐培元，等.HPLC测定藏药独一味胶囊中黄酮类成分的含量[J].中成药，2005，27(6)：657.
       
       [5] 李茂星，贾正平，胡之德.藏药独一味中总环烯醚萜苷的含量测定[J].华西药学杂志，2007，22(2)：208.