文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究大黄、虫对大鼠子宫肌瘤模型孕激素及其受体的影响。方法将70只SD大鼠随机分为7组:正常对照组、模型组、大黄虫小剂量组、大黄虫中剂量组、大黄虫大剂量组、大黄虫丸组、桂枝茯苓胶囊组，采用雌孕激素负荷法建立大鼠子宫肌瘤模型，放射免疫法测定大鼠血清孕激素(P)水平，免疫组织化学染色观察大鼠子宫平滑肌细胞孕激素受体(PR)的表达。结果模型大鼠血清中P水平，子宫平滑肌细胞PR的表达明显高于正常大鼠,大黄虫可降低血清中P水平，抑制平滑肌细胞PR的表达。结论P及PR在子宫肌瘤生长中起重要作用，这可能是大黄虫治疗子宫肌瘤的机理之一。
       【关键词】  大黄、虫; 子宫肌瘤模型; 孕激素; 孕激素受体
       Effects of Da Huang and Zhe Chong on the Concentration of Progesterone and its Receptor in Uterine Leiomyomas Induced by Estrogen and Progesterone Load
       ZHU Lihong1, HU Tingting2, YAN Weina2
       (1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang, Shanxi 712046, China; 2. Graduate Student of Grade 2006, Shanxi College of TCM, Xianyang, shanxi 712046, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of Da Huang and Zhe Chong on the concentration of progesterone and its receptor in the experimental rats with uterine leiomyomas. Methods70 female Sprague-Dawley rats were randomly divided into 7 groups: control group, model group, low dosage group of Da Huang and Zhe Chong, medium dosage group of Da Huang and Zhe Chong，higher dosage group of Da Huang and Zhe Chong，Da Huang Zhe Chong Wan group, Gui Zhi Fu Ling Capsula group. The animal model of uterine leiomyomas was induced by estrogen and progesterone load method. The serum concentration of progesterone was measured by radioimmunoassay (RIA), and the expressions of progesterone receptor in smooth muscle cells was detected by immunohistochemistry. ResultsCompared with control group, the concentration of progesterone and expression of progesterone receptor in smooth muscle cells in model group were changed significantly(P >0.05). Da Huang and Zhe Chong were demonstrated to reduce the concentration of progesterone, suppress the expression of progesterone receptor.ConclusionThe concentration of progesterone and progesterone receptor play important role in the growth of uterine leiomyomas, and it may be one of reasons by which Da Huang and Zhe Chong treat uterine leiomyomas.
       Key words：Da Huang and Zhe Chong; Models of the uterine leiomyomas; Progesterone; Progesterone receptor
       子宫肌瘤是女性生殖器官中最常见的良性肿瘤，也是人体最常见的肿瘤之一，它好发于生育年龄(30～50岁)的妇女，以40～50岁最多见，20岁以下少见[1]。虽恶变率极低,但所引发的子宫出血、腹痛、不孕、贫血等严重影响妇女身心健康。子宫肌瘤确切的发病原因至今尚不清楚，但与卵巢性激素密切相关，是公认的激素依赖性肿瘤。中医学中无“子宫肌瘤”的病名，根据其临床表现，属“癥瘕”范畴，即妇女下腹包块，伴有或痛或胀或满或阴道出血溢液等症状的病证，其病机关键是瘀血内阻。大黄、虫对药组合出自经方下瘀血汤、大黄虫丸等，具有活血化瘀，消散癥积之功用。两药相须为用，大黄入血偏于泻，虫入血偏于通，使脉络畅通，瘀血得散[2]。本实验以雌孕激素负荷法造模，观察大黄、虫对药组合对子宫肌瘤模型大鼠孕激素及其受体的影响，进一步探讨其作用机制。
       1 材料
       1.1 动物清洁级健康雌性SD大鼠，70只，一级动物，体质量150～170 g。SPF级饲料、垫料购自第四军医大学实验动物中心，饲养于陕西中医学院中西医结合妇科重点学科实验室。
       1.2 药物及试剂大黄虫对药，购自陕西中医学院金秋门诊;大黄虫丸，成都永康制药有限公司生产;桂枝茯苓胶囊，连云港康缘制药有限责任公司生产，0.31g/粒。苯甲酸雌二醇注射液，上海第九制药厂生产，1mg/ml，批号：H12021529;黄体酮注射液，20mg/ml，上海通用药业股份有限公司生产，批号：H33020828，用高压灭菌花生油稀释至5mg/ml;配制4%多聚甲醛溶液，500ml/瓶;碘[125I]孕激素放射免疫分析药盒，天津九鼎医学生物工程有限公司生产;兔抗人、大、小鼠PR多克隆抗体及SP-0023免疫组化染色试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司生产;浓缩型DAB试剂盒，北京中山试剂公司生产。
       2 方法
       2.1 动物造模及分组给药适应性饲养3 d，保持实验室温度18～28℃，相对湿度50%～75%，自然通风。随机分为7组，造模方法在国外研究基础上[3]加以改进，即正常对照组每周一、三、五、日肌肉注射高压灭菌花生油0.2 ml/d，共20周。第11周起予蒸馏水灌胃2 ml，每周6次，连续10周。其余组每周一、三、五、日肌肉注射苯甲酸雌二醇0.1 mg/d，共20周。从第14周起每周肌肉注射黄体酮1次0.5 mg/d，共7周。模型组于第10周末处死两只，进行预实验。第11周起对药组分别给予大黄、虫对药悬液2 ml灌胃，小、中、大剂量分别含生药约0.3，0.62，1.25 g /ml。同时设药物对照组，即大黄虫丸颗粒悬液2 ml灌胃组，含生药约0.08 g/ml;桂枝茯苓胶囊悬液2 ml灌胃组，含生药约0.04 g/ml，每周6次，连续10周。
       2.2 生物样本取材及观察指标第20周末处死所有大鼠，心脏采血[4]。以3 500 r/min离心5 min，分离血清备用。解剖分离大鼠子宫，使之离体，拍照。4%多聚甲醛固定子宫标本，石蜡包埋、切片、HE染色，生物显微镜观察平滑肌细胞的病理改变。取出血清，用放射免疫γ计数器(FM-2000)全自动计数，按试剂盒要求测定血清孕激素(P)水平。分别在双侧宫角最大直径及宫颈处取材3块，脱水、石蜡包埋、HE染色。按试剂盒说明进行SP法免疫组化染色。读片参照Formwitz评分法，根据阳性细胞百分率及染色深浅分级，以切片中部细胞作为基数100%,根据受体阳性细胞的百分数分四级：0级(阴性)：阳性细胞25%或不染色;(+)级(弱阳性)：阳性细胞25～50%，阳性染色较清晰;(++)级(阳性)：阳性细胞51～75%，阳性染色清晰;(+++)级(强阳性)：阳性细胞75%，细胞核为棕黄色[3]。每例各取5个视野(均为环行平滑肌层)，测定PR阳性表达。
       2.3 数据处理采用SPSS10.0统计软件处理，结果用±s表示, 组间差异比较用单因素方差分析。
       3 结果
       3.1 雌、孕激素负荷造模后，大鼠子宫大体观改变见图1。
       a-正常对照组子宫(20周末) b,c-模型组子宫(20周末)
       d-模型组子宫(10周末)
       图1 雌、孕激素负荷造模后，大鼠子宫大体观改变
       正常对照组动物子宫质地均匀，色泽鲜亮粉红，未见结节、囊肿及肿胀。雌、孕激素负荷造模组动物于第10周末解剖时可见子宫形态改变，明显肿胀增生，个别动物子宫角可见肿块，且子宫色泽变暗。第20周末时，子宫形态进一步改变，结节、肿胀、增生更加明显。
       3.2 雌、孕激素负荷造模后，大鼠子宫病理组织学特征见图2。
       HE染色显示，正常对照组大鼠子宫平滑肌肌层较薄，平滑肌细胞细长，排列整齐。模型组大鼠子宫平滑肌增生，细胞排列紊乱，肌纤维或较长或短粗，纤维束之间有结缔组织纤维，有的肌层细胞纵横交错，呈栅栏状改变。
       3.3 不同实验组对孕激素(P)的影响见表1及图3。
       a-正常对照组(20周末，HE，20×) b-模型组(20周末，HE，20×)
       图2 雌、孕激素负荷造模后，大鼠子宫病理组织学特征(HE，20×)表1 不同实验组对大鼠孕激素的影响
       组别nP/ng·ml-1正常对照958.72±24.16模型1082.24±12.73b大黄虫小剂量974.48±9.87大黄虫中剂量1066.66±15.42c大黄虫大剂量1072.91±11.84大黄虫丸1060.31±22.51d桂枝茯苓胶囊959.46±20.74d
       与正常对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较,cP<0.05，dP<0.01
       图3 不同实验组对大鼠孕激素水平的影响
       从表1及图3可见，与正常大鼠比较，模型组血清孕激素明显升高。与模型组比较，大黄虫3个剂量组可不同程度的降低大鼠血清中孕激素水平，以大黄虫中剂量组有明显统计学差异(P<0.05)。大黄虫丸、桂枝茯苓胶囊对大鼠血清孕激素水平也有显著抑制作用(P<0.01)。
       3.4 不同实验组对孕激素受体(PR)的影响见表2及图4～5。表2 不同实验组对大鼠孕激素受体的影响
       从表2以及图4～5中可见，孕激素受体(PR)阳性细胞核内呈现棕黄色颗粒。正常组大鼠子宫平滑肌部位PR阳性细胞呈少量、散在分布(图5a);模型组大鼠子宫平滑肌 PR 阳性细胞密度明显增强，其阳性信号表达呈强阳性(图5b)，与正常组比较，二者阳性表达率有极显著差异(P<0.01);大黄虫3个剂量组(图5cde)、大黄虫丸组(图5f)及桂枝茯苓胶囊组(图5g)大鼠子宫的 PR 阳性细胞密度明显降低，与模型组有极显著差异(P<0.01)。
       4 讨论
       子宫肌瘤是临床常见病、多发病，病因及发病机理十分复杂，涉及机体局部或整体雌、孕激素及其受体的变化、局部多肽生长因子、细胞分裂率的改变及体细胞突变等许多方面，其中卵巢激素依赖性已达成共识。我们采用外源性雌、孕激素负荷法建立子宫肌瘤模型。子宫大体各项指标如子宫湿重、子宫指数(子宫湿重/大鼠体重)、宫颈及宫体最大直径等均明显大于正常大鼠;HE染色显示其子宫平滑肌层出现局灶性增生，平滑肌排列紊乱，细胞增大，病理改变与子宫肌瘤病理组织学结构类似，说明造模成功。
       从20世纪70年代以来，中医治疗子宫肌瘤的学术探讨日趋活跃。经方治疗是最早使用并得到持续关注的治疗方法。结合历代对“癥瘕”的认识，我们认为，子宫肌瘤属癥积范畴，是实质包块，瘀血内阻是其病机关键，因此治宜破血消癥。大黄、虫对药组合出自《金匮要略》下瘀血汤、大黄虫丸等名方，大黄破积导滞、泻火凉血，行瘀通经;虫破血逐瘀，通络理伤。虫入肝经，走血分而化瘀血，大黄入血分而逐瘀血。二药配伍，相互促进，破血逐瘀，消癥散结之力大增。该对药组合善治瘀血导致的闭经、癥瘕(子宫肌瘤、卵巢囊肿、肝脾肿大等)、产后血瘀腹痛等[5]。
       本研究从经方对药入手，探讨活血化瘀治则对孕激素及其受体的影响。结果显示，大黄虫中剂量组血清孕激素较模型组显著降低，小、大剂量组无明显差异，说明大黄虫降低雌、孕激素的作用与大黄虫丸、桂枝茯苓胶囊作用相似。大鼠子宫平滑肌细胞PR的免疫组化染色结果也显示，正常组PR阳性表达率显著低于模型组，大黄虫用药组平滑肌细胞与模型组相比，PR蛋白含量明显下降。表明肌瘤局部PR的含量增高是其局部高激素水平和细胞增殖的主要原因。所以大黄虫治疗子宫肌瘤的机理都可能与降低体内孕激素及其平滑肌细胞受体含量有关。
       总之，从经方中挖掘关键对药组合研究子宫肌瘤者未见报道，本研究方案作为经方研究的新切入点，旨在筛选特效组合，为大黄、虫的临床疗效提供实验依据，并为进一步提取有效成分获得单体奠定基础。
       【参考文献】
         　[1] 乐 杰.妇产科学，第6版[M].北京：人民卫生出版社，2006： 295.
       
       [2] 王 付.经方对药[M].北京：学苑出版社，2005：111.
       
       [3] Fujii S, Nakashima N ,Okamura H ,et al. Progesterone-induced smooth muscle-like cells in the subperitoneal nodules produced byestrogen. Experimental appnach to leiomyomatosis pevtorealis disseminate[J].Am J Obstet Gynecol, 1981, 139(2)：164.
       
       [4] 施新猷.现代医学实验动物学[M].北京：人民军医出版社，2000：31.
       
       [5] 吕景山.施今墨对药，第3版[M].北京：人民军医出版社，2007：244.