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       【摘要】 
       目的用反相-高效液相色谱法测定生化汤各配伍组合中的阿魏酸的含量，研究不同配伍对阿魏酸溶出的影响。方法采用L8(27) 正交设计法,以HPLC法测定各配伍样品中阿魏酸含量。结果川芎和甘草对生化汤中阿魏酸的溶出量具极显著的影响作用(P<0.01);川芎和桃仁、川芎和甘草的交互效应对阿魏酸的溶出量则具显著的影响作用(P<0.05);而桃仁、桃仁和甘草的交互效应、炮姜对阿魏酸的含量没有显著性影响(P>0.05)。结论生化汤中川芎明显增加生化汤中阿魏酸的溶出量，甘草及川芎和桃仁、川芎和甘草的两两交互效应可显著降低阿魏酸的含量。
       【关键词】  生化汤; 配伍; 阿魏酸; 高效液相色谱
       Influence of Compatibility on Ferulic Acid solution in Shenghua Decoction
       DU Qian, TANG Daoquan, CHEN Yonggang, LIU Xiao， GAO Yuanyuan
       (Xuzhou Medical College,Xuzhou 221004,China)
       Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for determination of ferulic acid in decoctions prepared from various combinations of the recipe named Shenghua Decoction and to investigate the content changes of ferulic acid in different decoctions.MethodsContent of ferulic acid in each decoction was determined by RP-HPLC with L8(27) orthogonal design.ResultsSzechwan Lovage Rhizome and Liquorice Root had exceedingly significant effect on the content of ferulic acid in this decoction(P<0.01); Szechwan Lovage Rhizome and Peach Seed, Szechwan Lovage Rhizome and Liquorice Root had significant effect on the content of ferulic acid in this decoction(P<0.05); the effect of Peach Seed, Prepared Dried Ginger , Peach Seed and Liquorice Root on the content of ferulic acid was not significant. ConclusionThe content of ferulic acid is increased by Szechwan Lovage Rhizome and reduced by Liquorice Root, Szechwan Lovage Rhizome and Peach Seed, Szechwan Lovage Rhizome and Liquorice Root.
       Key words： Shenghua Decoction; Compatibility; Ferulic Acid; HPLC
       生化汤由当归、川芎、桃仁、炮姜及甘草等5味中药组成，功能活血化瘀，调经止痛。本方源自南宋末年的《女科秘要》，至清代被《傅青主女科·产后编》收录，阿魏酸可抑制血小板聚集、促进血小板的解聚、抗血栓的形成、解除血管平滑肌痉挛、抗氧化等药理作用[1]，为方中主要有效成分。本实验采用正交实验法研究该方不同配伍对阿魏酸溶出的影响，以从化学角度探讨生化汤的配伍组方机制。
       1 仪器与试药
       1.1 仪器 Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)。包括SCL-10Avp System Controller; SPD-M20A DAD;FCV-10AL vp;SIL-20A Auto Sampler;LC-Solution 1.22 SP1(色谱数据工作站);自动双重纯水蒸馏器(型号SZ-93，上海亚荣生化仪器厂); Ultrasonic Generator(型号H66MC,无锡超声电子设备有限公司);梅特勒托利多AE240电子天平(十万分之一，瑞士MettlerTole-do)。甲醇(色谱纯,美国J.T.BAKER公司);水为双蒸水;其余试剂为分析纯。
       1.2 药品 对照品阿魏酸(批号：06081427)由上海同田生物科技有限公司提供。当归、川芎、桃仁、甘草及炮姜等药材由江苏省徐州市药材公司提供，经徐州医学院中药教研室王健慧副教授鉴定，当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根[2];川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎;桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica (L.) Batsch的干燥成熟种子;炮姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎的炮制加工品;炙甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎的炮制加工品。
       2 方法与结果
       2.1 生化汤中阿魏酸的含量测定
       2.1.1 色谱条件 [3]色谱柱为Hypersil-C18(大连伊利特有限公司出品，250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温28℃，检测波长320 nm，进样量20 μl，流速1.0 ml/min。流动相A为0.5%冰醋酸水溶液,流动相B为甲醇;线性梯度洗脱,洗脱程序：0～5 min, 25%～30% B;5～20 min, 30%～50% B; 20～25 min, 50%～25% B。
       2.1.2 对照品溶液和供试品溶液的制备
       对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸对照品5.18 mg，50%甲醇水溶液溶解后，用流动相定容于5 ml棕色容量瓶中，得1.036 mg/ml对照品贮备液。从中精密量取适量，用流动相配成浓度为 0.025 9，0.051 8，0.103 6，0.207 2，0.310 8，0.414 4，0.518 0 mg/ml的系列标准工作液。
       供试品溶液的制备：按处方配比称取生化汤各味药材饮片(当归24 g，川芎9 g，桃仁6 g，甘草2 g，炮姜2 g)及缺当归、川芎阴性方,分别加全方生药量的10倍水，微沸煎煮3次, 1h/次，过滤，合并滤液，浓缩至1 ml药液含1 g药材 ,备用。精密吸取上述样品液2.5 ml，置10 ml容量瓶中，加水定容至刻度, 离心(4 000 r/min) 15min，上清液经0.45 μm 滤膜滤过，配制成供试品溶液。依法进样测定，对照品、供试品、阴性对照色谱图见图1～3。
       图1 对照品HPLC图谱(1-阿魏酸，tR=15.312)
       图2 供试品HPLC图谱
       图3 阴性对照品溶液HPLC图谱
       2.1.3 线性关系考察精密吸取前“对照品溶液的制备”项下已制备的各不同浓度的对照品溶液20 μl注入色谱仪，测定峰面积，以阿魏酸浓度(mg/ml)为横坐标(X) ,峰面积为纵坐标( Y),进行线性回归,得回归方程为Y=1.055 2×10-8 X + 5.251×10-3 , r =0.999 7,阿魏酸在0.025 9～0.518 0 mg/ml之间呈良好的线性关系。
       2.1.4 精密度实验精密移取供试品20 μl，重复进样6次(每针间隔约30 min)，测定峰面积，计算其RSD为0.498%。
       2.1.5 重复性实验 取生化汤处方药材,按供试品溶液制备方法处理，制成6份供试品溶液,按上述色谱条件进样测定,结果平均含量为0.080 29 mg/ml，RSD为0.830%。
       2.1.6 稳定性实验取同一份供试品溶液，在配制后0，2，4，6，8，12，24 h进样，测定阿魏酸含量，其RSD=0.564%，表明24 h内溶液稳定。
       2.1.7 回收率实验 精密移取0.15 ml已知含量的生化汤水煎液9份，每3份分别精密加入浓度为0.103 6 mg/ml的阿魏酸对照液0.10，0.12，0.15 ml，依次测定阿魏酸含量。结果见表1。
       2.2 不同配伍条件对阿魏酸含量的影响
       2.2.1 正交设计 固定当归，以川芎、桃仁、炮姜、甘草为4因素，水平设为“有”和“无”， 并考虑两两交互作用，因素水平见表2。表1 加样回收率测定结果表2 因素水平
       2.2.2 供试品溶液的制备按前“供试品溶液的制备”项下方法，实验安排及测定结果见表3。表3 正交设计
       2.2.3 结果分析直观分析结果显示，对阿魏酸的影响为：川芎>甘草>川芎×桃仁>川芎×甘草>桃仁×甘草>桃仁>炮姜。方差分析结果见表4。表4 方差分析
       由表4可以看出，川芎和甘草对生化汤中阿魏酸的溶出量具极显著的影响作用(P<0.01);川芎和桃仁、川芎和甘草的交互效应对阿魏酸的溶出量则具显著的影响作用(P<0.05);而桃仁、桃仁和甘草的交互效应对阿魏酸的含量没有显著性影响(P>0.05)。
       3 讨论
       本实验采用L8(27)正交设计及EXCEL软件对生化汤中的阿魏酸含量进行分析，结果表明，在P<0.01水平下，川芎明显增加生化汤中阿魏酸的溶出量，甘草的加入明显抑制了阿魏酸的溶出;在P<0.05水平下，川芎和桃仁、川芎和甘草的交互效应显著降低阿魏酸的含量;桃仁、桃仁和甘草的交互效应及炮姜对阿魏酸的溶出影响无显著性。
       笔者分析，川芎可增加阿魏酸溶出，是因为川芎本身含有阿魏酸，与当归的阿魏酸具加和性，与当归起协同作用;甘草可明显抑制阿魏酸溶出，可能是由于甘草中含有酸性皂苷成分，从而抑制了有机酸成分-阿魏酸的溶出;而川芎和桃仁交互可降低阿魏酸含量的机制，有待于深入探讨。
       笔者在实验中曾尝试使用二极管阵列检测器同时测定阿魏酸和川芎嗪的含量，以使实验结论更具说服力，流动相先后更换了甲醇-冰醋酸;乙腈-冰醋酸;甲醇-磷酸;甲醇-磷酸盐等系统，但由于川芎嗪在全方中含量过低，仍未成功建立合适的色谱条件。拟在下一步实验进程中，建立生化汤全方的指纹图谱，以期对生化汤的配伍机理及物质基础做进一步探讨。
       【参考文献】
         　[1] 王雁梅,史恒军,王保秀,等.生化汤药理学研究进展[J].中国药房，2005,16(6):470.
       
       [2] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005:89.
       
       [3] 宋金春,罗顺德,蔡鸿生,等.反相高效液相色谱法测定生化汤中阿魏酸及其血药浓度[J].中国医院药学杂志, 2001,21(4):213.