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       【摘要】 
       目的探讨香菇多糖对荷瘤小鼠S100+ 胸腺树突状细胞(TDCs)和CD1a+ TDCs表达的影响。方法观察胸腺结构;通过S100和CD1a免疫组化标记，计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比;计算TDCs密度;测算胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率等指标。结果荷瘤香菇多糖组TDCs数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高，位于成簇的淋巴细胞之间，树状突起与淋巴细胞相接触。荷瘤香菇多糖组S100+ TDCs所占面积比和TDCs密度均比其他各组明显增高(P<0.01)。结论香菇多糖能增加TDCs数量及促进其分化成熟。
       【关键词】  香菇多糖; S180; 树突状细胞; 免疫组织化学
       Effect of Lentina on Thymus Dendritic Cells in S180 Tumor-bearing Mice
       LIN Kali1, LIN Kaqin2, ZHONG Ruichong1, HE Fangxing1, CHEN Weiqin3
       (1.Department of Histology and Embryology, Gannan Medical College,Ganzhou, Jiangxi 341000, China;
       2.Quannan Hospital, Ganzhou, Jiangxi 341000, China; 3. Grade 2005, Student of Gannan Medical College, Ganzhou, Jiangxi 341000, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the influence of lentina on expression of thymus S100+ dendritic cells (DCs) and CD1a+ DCs in S180 tumor-bearing mice.MethodsThymus morphology and thymus DCs (TDCs)immunostaining with DCs marker(including S100 and CD1a) were observed and analyzed with stereologic method.The thymus index and tumor index were measured.ResultsThere were more TDCs in the tumor lentinan group than others , especially in cortex, locating between lymphocytes. S100+ TDCs area and TDCs density in the tumor lentinan group were significantly higher than others(P<0.01) .ConclusionLentinan can promote quantity increase, differeation and maturation of TDLs.
       Key words：Lentinan; S180; Dendritic cell; Immunohistochemistry
       中医理论认为香菇味甘性平，健脾益气，调和阴阳，食药兼用，民间还用其辅助治疗多种病症。从香菇的子实体提取物中获取的主要有效成分——香菇多糖，作为一种天然的免疫调节剂，对各种恶性肿瘤有较好的防治作用[1]。研究报道，香菇多糖可增强肿瘤组织内浸润淋巴细胞的扩增，在实验动物中有促进B淋巴细胞的分化、增殖，增强免疫功能的作用[2,3]。Mushiake等[4]的研究结果还表明：香菇多糖能通过改善树突状细胞(dendritic cells, DCs)功能，调节DCs介导的特异性免疫，增强抗瘤活性，最终提高荷瘤鼠的存活率。本课题组的前期研究工作也证实香菇多糖抗肿瘤作用与增加免疫细胞数量有关，可使脾指数增加，脾白髓面积与脾小体个数增加，使外周血淋巴细胞绝对数增加[5,6]。在此基础上，我们重点观察了香菇多糖对荷瘤S180鼠胸腺结构，特别是对胸腺树突状细胞(thymus dendritic cells,TDCs)分布和数量的影响，以及与肿瘤消长的关系，以期进一步为香菇多糖促进中枢免疫器官功能，加强抗肿瘤作用的研究提供实验依据。
       1 材料
       1.1 材料与试剂小鼠S180细胞株(Sarcoma180)由中国医学科学院医药研究所购进，本院科研中心传代培养。兔抗小鼠S100，兔抗小鼠CD1a和SABC试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。注射用香菇多糖生产厂家：南京康海药业有限公司。环磷酰胺生产厂家：江苏恒瑞医药股份有限公司。DT2000图像分析软件V2.0。SPSS14.0统计软件包。
       1.2 荷瘤S180鼠模型的建立取已接种7 d肿瘤生长良好的S180腹水型小鼠，抽吸乳白色的浓稠腹水以无菌生理盐水稀释后，用血球计数板进行活细胞计数，调整细胞数为1×107，制成肿瘤细胞悬液(活细胞率﹥95%)。在小鼠右前腋皮下注射0.2 ml S180细胞悬液，制成实体瘤模型。
       2方法
       2.1 动物及分组清洁级昆明小鼠40只，雌雄各半，6～8周龄，体质量20～24 g，购自江西中医学院实验动物中心，卫生许可证号：SCXK(赣)2006-0001，实验动物质量合格证号： JZDW 2008-0205。小鼠随机分为4组。第Ⅰ组为正常盐水对照组，右前腋皮下注射0.2 ml生理盐水，9 d后处死;第Ⅱ组为荷瘤模型组，第Ⅲ组为荷瘤环磷酰胺组，第Ⅳ组为荷瘤香菇多糖组，这3组于接种肿瘤后第2天始分别每日腹腔注射生理盐水0.2 ml，环磷酰胺0.2 ml(每只每次1 mg)，以及香菇多糖0.2 ml(每只每次0.025 mg)，共7次，均于最后1次给药后第2日处死。
       2.2 普通光镜检查小鼠断头处死，剥离胸腺组织，称重后入4%多聚甲醛溶液中固定。低温石蜡包埋制片，HE染色，Olympus显微镜观察。
       2.3 免疫组织化学标记和观察分析将胸腺石蜡标本制成厚4 μm的石蜡切片。0.1%胰蛋白酶消化30 min(37℃)，一抗4℃过夜(S100和CD1a工作浓度均为1∶150)。余按试剂盒作SABC免疫组化技术处理。DAB显色。不复染或1%甲基绿轻度复染。
       阴性对照样品：以PBS代替一抗进行标记。
       用DT2000图像分析软件V2.0计数单位面积胸腺切片中阳性颗粒的个数和面积，计算S100+细胞在参照物(胸腺)中所占面积百分比。使用DigiLab 2.0、Motic Images Plus 2.0 ML软件计算TDCs密度：每组随机选取50个高倍视野拍照(0.068 mm2)，计数S100+细胞的个数。TDCs密度=50个高倍视野S100+细胞总和/3.4 mm2(阳性颗粒最小直径≥ 2 μm 时认作一个细胞)。
       2.4 胸腺指数，肿瘤指数，抑瘤率的计算胸腺指数(mg/g)= 胸腺质量(mg)/小鼠体质量(g);肿瘤指数(mg/g)= 肿瘤质量(mg)/小鼠体质量(g);抑瘤率(%)=(荷瘤模型组肿瘤质量-荷瘤药物实验组肿瘤质量)/ 荷瘤模型组肿瘤质量×100%。
       2.5 统计学处理采用统计学软件包SPSS14.0，结果用±s表示，各实验组之间的比较采用单因素方差(ANOVA)分析，显著性水准为α=0.05。
       3 结果
       3.1 光镜观察正常对照组小鼠胸腺皮质密集分布着核深染的小淋巴细胞，髓质结构较疏松，淋巴细胞成分较少。在胸腺皮质、髓质以及皮髓质交界处，均分布着一些体积较大、胞体呈多角形或分支状，核形状不规则的浅染细胞，即为TDCs。荷瘤香菇多糖组TDCs数量明显增加，特别在胸腺皮质密度很高，位于成簇的淋巴细胞之间，树状突起与淋巴细胞相接触。
       3.2 各组小鼠胸腺指数、肿瘤指数和抑瘤率的比较荷瘤小鼠与正常对照组相比，胸腺指数均下降，尤其是荷瘤环磷酰胺组下降更为明显。应用香菇多糖后，胸腺指数回升接近正常值，与荷瘤环磷酰胺组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，与正常对照组比较无统计学意义;药物实验组肿瘤指数与荷瘤模型组相比较，均有统计学意义(P<0.01)。结果见表1。表1 各组小鼠胸腺指数、肿瘤指数和抑瘤率的比较与正常盐水对照组比较，**P<0.01; 与荷瘤模型组比较，△△P<0.01;与荷瘤环磷酰胺组比较，▲▲P<0.01;n=10
       3.3 香菇多糖对S180荷瘤小鼠TDCs的影响对比观察免疫组化染色及HE染色切片，可见HE染色中显示的TDCs多数能表达S100和CD1a。S100标记示TDCs胞浆内有深棕色颗粒表达(部分TDCs细胞核也有表达)。荷瘤香菇多糖组胸腺皮质中见大量S100阳性表达的TDCs，髓质有数量较少的TDCs，，但细胞体积较大，而其他各组胸腺髓质S100阳性表达TDCs量很少(见图1，图2)。各组小鼠S100+ TDCs所占面积比和TDCs密度的比较见表2。CD1a标记主要表达在TDCs细胞膜上，呈棕色阳性反应。因阳性较弱，未作图像分析(见图3)。表2 各组小鼠TDCs所占面积比和TDCs密度的比较
       4 讨论
       研究表明，香菇多糖具广泛的免疫调节作用，可通过增加脾细胞增殖和IL-2的表达水平，以及通过激活脾细胞受体信号转导等方式增强免疫[7]。本实验表明，香菇多糖能改善由于肿瘤以及应用环磷酰胺引致的胸腺指数下降，与荷瘤环磷酰胺组比较，有统计意义(P<0.01)。注射香菇多糖后能使肿瘤指数下降，平均瘤重由荷瘤模型组的1.418 1下降为0.916 4，抑瘤率达到40.817%。对肿瘤指数与胸腺指数两个参数的相关分析表明两者为负相关关系(r= -0.660 6,P=0.019 )。这提示：香菇多糖可能通过保护和恢复胸腺功能，加强免疫调节和免疫应答，达到抗肿瘤之目的。
       DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，它几乎存在于所有哺乳类动物组织中，通过识别和传递抗原肽给T细胞而参与免疫，外周DCs可迁入胸腺，以便更高效率地诱导T细胞分化增殖，由它激活的细胞免疫应答在机体抗肿瘤中起主导作用[8，9]。有证据表明：荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，而是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。胸腺作为机体含DCs最多的中枢免疫器官，在抗肿瘤免疫中，TDCs会发生怎样的变化，鲜有报道。TDCs有多种在细胞水平标记和识别的方法。通常用S100标记成熟的TDCs，用CD1a标记未成熟TDCs。本实验通过多种树突状细胞标记物联合标记，结合光镜形态观察，表明小鼠荷S180肉瘤后，TDCs数量减少，而在应用香菇多糖后TDCs数量增加。尤其是S100+ TDCs，即成熟TDCs增加，且不仅出现在皮质，在胸腺髓质也出现较多体积较大的成熟TDCs。与其他各组比较，荷瘤香菇多糖组TDCs密度增加具有统计意义(P<0.01)。以上结果表明：香菇多糖能增加TDCs数量并促进其分化成熟，增强其抗原提呈能力，从而加强活化T细胞启动细胞免疫功能。这可能是香菇多糖抗肿瘤的机理之一。
       【参考文献】
         　[1] 于淑池,林泽平.香菇多糖的营养保健及免疫调节作用[J].承德民族师专学报, 2003，23(2): 82.
       
       [2] 李广宙,康 白,张 磊.香菇多糖与IL-2合用对肺癌浸润淋巴细胞抗肿瘤活性的影响[J].潍坊医学院学报,2000,22(1):20.
       
       [3] 金亨燮,崔仁花,李承宪.香菇多糖的化学结构与药理功效[J].延边大学农学学报, 2004, 26 (2):113.
       
       [4] Mushiake H, Tsunoda T, Nukatsuka M,et al.Dendritic cells might be one of key factors for eliciting antitumor effect by chemoimmunotherapy in vivo[J].Cancer Immunol Immunother. 2005，54(2):120.
       
       [5] 林卡莉,辛赣海,陈 方.香菇多糖改善S180荷瘤鼠免疫功能的体视学研究[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2008，17(4)：398.
       
       [6] 陈同强,林卡莉,邓 婷.香菇多糖对荷瘤小鼠胸腺、脾和肿瘤的影响[J].解剖学杂志，2008，31(4)：508.
       
       [7] Chen HL, Li DF, Chang BY, et al.Effects of lentinan on broiler splenocyte proliferation, interleukin-2 production, and signal transduction[J].Poult Sci. 2003，82(5):760.
       
       [8] Bodey B, Siegel SE, Kaiser HE. Antigen presentation by dendritic cells and their significance in antineoplastic immunotherapy[J].In Vivo. 2004，18(1):81.
       
       [9] Proietto AI, van Dommelen S, Zhou P,et al.Dendritic cells in the thymus contribute to T-regulatory cell induction[J].Proc Natl Acad Sci U S A. 2008，105(50):19869.