文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究白背叶提取物WF对乙肝病毒的抑制作用。方法接种2215细胞24 h后，加入不同浓度的白背叶提取物WF培养8 d，以细胞形态学的变化为指标评价WF对2215细胞的毒性。收集最大无毒浓度下的培养液，酶联免疫法(ELISA)检测培养液中HBsAg和HBeAg水平。结果在最大无毒浓度下，WF对2215细胞HBsAg和HBeAg的分泌有明显抑制作用。WF抑制HBsAg的半数有效量(IC50)为8.61 μg/ml;抑制HBeAg的IC50为20.87 μg/ml。结论WF可明显抑制2215细胞HBsAg和HBeAg的分泌，具有显著的抗乙肝病毒作用。
       【关键词】  白背叶提取物; 2215细胞; HBsAg; HBeAg
       Effect of Mallotus apelta Extract WF on HBsAg and HBeAg Secretion in 2215 Cells
       XIA Xing, ZHENG Zuowen*, TAN Wei
       (Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning, Guangxi 530001, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the anti-HBV effect of WF.Methods2215 cells were cultured for 24 h, then different concentration of WF were added and cultured for 8 d, and the WF"s toxicity was evaluated according to the morphological alteration of 2215 cells. The supernate of culture was collected at the non-toxic concentration of WF, enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the HBsAg and the HBeAg levels in the supernate. ResultsThe non-toxic concentration of WF inhibited HBsAg and HBeAg secretion of 2215 cells significantly (P<0.01), and the 50% inhibiting concentration (IC50) of WF on HBsAg secretion was 8.61 μg/ml, while the IC50 on HBeAg secretion was 20.87 μg/ml. ConclusionWF can inhibit HBsAg and HBeAg secretion of 2215 cells effectively, indicating that WF may have anti-HBV activity.
       Key words：Whitebackleaf extractants; 2215 cell; HBsAg; HBeAg
       白背叶为大戟科植物Mallotus apelta (Lour.) MuelL.-Arg.，具有清热利湿、解毒止血、止痛之功，常用于治疗肠炎腹泻、慢性肝炎、脾脏肿大及跌打损伤等[1]。有研究发现，白背叶根水煎液对体外培养的2215细胞有显著的抗肝炎病毒作用[2]，且该作用在鸭乙肝病毒实验研究中亦得到证实[3]。此外白背叶还具有较好的抗肝纤维化和抗肝损伤作用[4，5]。本研究采用白背叶中提取出的有效成分群WF，评价其对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响，进一步探讨白背叶提取物WF的抗乙肝病毒作用。
       1 材料与仪器
       1.1 药物WF为棕褐色粉末结晶，由广西中医学院中药化学教研室提供。
       1.2 试剂 Eagles MEM干粉(美国GIBCO公司产品);胎牛血清(美国Hyclone Lab公司产品);G-418(Genticin 产品);L-谷氨酰胺(Amresco分装);卡那霉素(Amresco分装); DMSO(博大泰克公司产品);0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone Lab公司产品);乙肝表面抗原测试盒(上海荣盛生物技术有限公司，批号:20070605);乙肝e抗原测试盒(上海荣盛生物技术有限公司，批号:20070709)。
       1.3 仪器DLF560型超净工作台(荷兰clear Air Techniek bv公司产品);311二氧化碳培养箱(美国ThermoForma公司产品);倒置显微镜(德国LEICA BMIRB产品);酶标仪(奥地利SUNRISE产品);培养瓶(加拿大BIOFIL 公司产品);96孔板(美国Corning公司产品);微量移液器(法国Gilson公司产品);十万分之一电子天平(美国赛多利斯仪器系统有限公司产品)。
       1.4 2215细胞2215细胞由美国Mount Sinai医学中心构建，中国医学科学院医药生物技术研究所惠赠。
       2 方法
       2.1 细胞培养液配制 MEM培养液100 ml：含胎牛血清10%，谷氨酰胺300 μg/ml，G-418 380 μg/ml，卡那霉素750 μg/ml。用5%NaHCO3调pH值至7.2～7.4。
       2.2 2215细胞培养 2215细胞于含10%胎牛血清的MEM培养液中，置37℃、5%CO2培养箱培养，2～3 d换培养液1次，约7～10 d长满培养瓶。
       2.3 白背叶提取物WF对2215细胞的毒性实验[6] 实验设细胞对照组和7个用药组，药物终浓度分别为150，75，37.5，18.75，9.38，4.69，2.34 μg/ml，每组设3个复孔。细胞长满后，经0.25%胰酶消化，调整细胞浓度至105 cells/ml，接种于96孔板，每孔0.2 ml。培养24 h后弃原培养液，细胞对照组加正常培养液，用药组加含药培养液，培养3 d。至培养第4天，各组均换正常培养液，继续培养4 d。至培养第8天，于倒置显微镜下观察细胞形态学改变并拍照。以细胞形态学病变为指标评价WF对2215细胞的毒性，按Reed-Muench法将细胞受损百分率高于25%的认为药物有细胞毒性，低于25%的即认为细胞未受药源性损伤，由此确定最大无毒浓度。收集最大无毒浓度及低于该浓度WF培养的各孔上清，供HBsAg和HBeAg测定用。
       2.4 白背叶提取物WF对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用[6]取“2.3”中备用上清，按HBsAg和HBeAg酶联免疫试剂盒说明书测定HBsAg和HBeAg的OD值。抗原抑制率、IC50分别按下式计算。
       抗原抑制百分率(%)=细胞对照OD值-给药实验OD值细胞对照OD值×100% (公式一)
       IC50=
       lg-1[50-小于50%抑制百分率B+(大于50%抑制百分率-小于50%抑制百分率)×(A-B)] (公式二)
       其中：A=lg(抑制率大于50%的药物浓度)
       B=lg(抑制率小于50%的药物浓度)
       2.5 统计分析实验结果均以±s表示。采用t检验分析各组间差异，P<0.05即认为差异达到显著。
       3 结果
       3.1 白背叶提取物WF对2215细胞的毒性作用 细胞培养8 d后，倒置显微镜下观察，见不同浓度的WF培养导致细胞出现不同程度死亡，其中150 μg/ml组细胞约98%死亡;75 μg/ml组细胞约40%死亡，细胞皱缩;37.5 μg/ml组细胞约15%死亡，细胞皱缩;18.75 μg/ml组及该浓度以下组细胞生长状态与细胞对照组比较细胞形态无明显改变，细胞数量也没有明显减少。
       3.2 白背叶提取物WF对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用 结果见表1～2。WF对2215细胞分泌HBsAg、HBeAg有明显抑制作用，其作用与浓度呈明显的正相关。WF浓度在37.5，18.75，9.38，4.69，2.34 μg/ml时，对细胞分泌HBsAg的抑制率分别为86.6%，70.04%，51.79%，37.39%，21.91%，与细胞对照组比较均有显著差异(P<0.01)，IC50为8.61μg/ml;对HBeAg，药物浓度在37.5，18.75，9.38，4.69，2.34 μg/ml时，抑制率分别为74.79%，45.46%，27.13%，16.25%，8.68%，与细胞对照组比较有显著差异(P<0.01)，IC50为20.87 μg/ml。表1 白背叶提取物WF对2215细胞分泌HBsAg的抑制作用表2 白背叶提取物WF对2215细胞分泌HBeAg的抑制作用
       4 讨论
       2215细胞是转染了HBV-DNA的肝癌细胞，该细胞株能长期稳定地分泌HBsAg、HBeAg，是目前抗乙肝病毒药物筛选的常用模型。国外采用2215细胞株，已筛选出有明显抗乙肝病毒作用的核苷酸类合成药物。张晓刚等[2]研究发现，白背叶根水煎液对2215细胞的TC50为48.25 mg/ml，而在31.25 mg/ml白背叶根水煎液对2215细胞分泌HBsAg及HBeAg的抑制率分别为58.63%和78.29%。本研究发现白背叶提取物WF在37.5 μg/ml浓度下对2215细胞无明显毒性，但对2215细胞分泌HBsAg及HBeAg的抑制率分别达到了86.6%和74.79%，提示WF可能是白背叶中抑制2215细胞分泌HBsAg及HBeAg的主要有效成分之一。
       本研究结果表明白背叶提取物WF在无明显细胞毒性浓度范围内，对2215细胞分泌HBsAg、HBeAg有明显的抑制作用，且该作用与WF浓度正相关。结果提示WF可能是白背叶抗HBV的主要活性成分之一。
       【参考文献】
         　[1] 徐国钧. 中国药材学，上册 [M]. 北京: 中国医药科技出版社, 1996: 272.
       
       [2] 张晓刚, 吕志平, 谭秦湘, 等. 白背叶根抗乙型肝炎病毒的体外实验研究[J].时珍国医国药, 2006, 17(8): 1437.
       
       [3] 徐 舒, 吕志平, 蔡红兵, 等. 白背叶根抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究[J]. 中西医结合学报, 2006, 4(3): 285.
       
       [4] 赵进军, 吕志平, 王晓东, 等. 白背叶根在肝纤维化动物模型中抗氧化作用的实验研究[J]. 中药材, 2002, 25(3):187.
       
       [5] 赵进军, 吕志平, 张绪富. 白背叶根对过氧化氢所致大鼠肝细胞损伤的保护作用[J]. 华西药学杂志, 2003, 18(4):257.
       
       [6] 郑作文. 藤茶总黄酮在2215细胞培养中对乙型肝炎病毒HBsAg，HBeAg和HBV-DNA的抑制作用[J]. 山东中医杂志, 2003, 22(9): 561.