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       【摘要】 
       目的探讨大鼠肝癌病变过程中虎眼万年青总皂苷(OCA-TS)对自由基代谢的影响。方法二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌动物模型，OCA-TS进行干预，用比色分析法动态检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、一氧化氮(NO)的含量。结果肝损伤硬化阶段、肝癌的发生发展阶段MDA含量逐渐增高，OCA-TS干预组MDA含量降低;肝损伤硬化阶段SOD活性增高明显，OCA-TS干预此阶段的SOD活性;在肝损伤硬化阶段、肝癌的发生发展阶段GSH-Px活性逐渐降低，以肝癌发展阶段明显，OCA-TS具有提高GSH-Px的活力作用;肝癌变阶段NO含量明显降低，OCA-TS具有提升NO含量作用。结论OCA-TS具有干预自由基代谢作用，抑制肝损伤硬化、肝癌的发生发展。
       【关键词】  虎眼万年青总皂苷; 肝癌; 二乙基亚硝胺; 实验; 自由基
       在肝癌及其它恶性肿瘤的启动、促进和形成发展的3个阶段中，均有自由基的产生与参与。自由基既可直接损伤DNA，也可通过脂类过氧化间接地损伤DNA，最终引起癌变。抗氧化能力是机体抵抗肿瘤的重要机制之一。长白山虎眼万年青为百合科多年生球根植物，民间全草入药，用于抗炎症、抗肿瘤等治疗。本实验应用二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌动物模型，动态观察虎眼万平青总皂苷(OCA-TS)在肝癌变过程中对自由基代谢的影响。
       1 材料与方法
       1.1 药物提取 取植物虎眼万年青，在自然条件下干燥，粉碎成粉。加入95%的乙醇浸泡24 h，纱布、滤纸过滤后，收集滤液，滤渣继续加入乙醇浸泡，同上方法循环 3次，收集滤液，将3次所得滤液合并。滤液经减压浓缩为原来体积的1/5，再用1/3体积的石油醚萃取脱脂，保留水相，再次减压蒸馏后，加水稀释上AB-8柱吸附，反复吸附3次，6～8倍柱体积水洗掉糖后用5倍柱体积95%乙醇洗脱皂苷。所得皂苷洗脱液，经D-280柱脱色后，减压浓缩后蒸干，即为虎眼万年青总皂苷。
       1.2 实验动物及设计 雄性Wistar清洁级大鼠50只，体质量130～150 g，购自延边大学医学部实验动物中心。动物适应3 d后开始实验。正常组：整个实验过程中均饮用灭菌自来水及基础饲料，并于18周末宰杀6只。模型组：每日给予基础饲料同时，用灭菌自来水配制浓度为95 μg/ml的二乙基亚硝胺(DEN)溶液(美国Sigma公司，避光保存，新鲜配制)，供大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的灭菌自来水4周，再继续饮含95 μg/ml的DEN溶液。并分别于饲养第12周末、14周末、18周末分别宰杀各6只。肝硬化预防组：于实验开始在肝癌模型建立的同时, 根据预实验小鼠虎眼万年青总皂苷的LD50为3.2 g/kg, 以接近于LD50之1/30的剂量，即相当于100 mg/kg的给药浓度，以蒸馏水制成所需浓度的混悬液,每日灌胃并分别于第12周末、14周末各宰杀6只。肝硬化治疗组：第10周后从模型组中随机选出8只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100 mg/kg，并于第14周末宰杀。肝癌治疗组：第14周后从模型组中随机选出8只，按模型组饲养同时给予虎眼万年青总皂苷100 mg/kg，并于第18周末宰杀。各组大鼠宰杀前禁食12 h，心脏取血，分离血清。
       1.3 试剂与方法 采用比色分析法检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，具体操作按试剂盒说明书进行。
       1.4 统计学方法 全部数据采用SPSS14.0 for Windows统计分析软件进行处理，进行t检验、方差分析。
       2 结果
       2.1 血清MDA水平模型组12，14，18周中MDA含量逐渐增高，以模型组18周含量最高。正常对照组、预防组12周与模型12，14，18周间有统计学差异(P<0.01)：肝硬化治疗组、预防组14周、肝癌治疗组与模型12，14，18周间有统计学差异(P<0.05)。结果见表1。
       2.2 血清SOD活力12周预防组低于12周模型组SOD活力，二者间有统计学差异(P<0.05)。12周后SOD活力无明显变化，接近正常对照组。模型12周与正常组、治疗硬化组、预防14周、模型14周、肝癌治疗组、模型18周间均有统计学差异(P<0.01)。预防组12周与模型14周、18周及治疗硬化组间均有统计学差异(P<0.05)。结果见表1。
       2.3 血清GSH-Px活力模型组12周、14周、18周时GSH-PX显著低于正常组，以模型18周时显著(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，模型12周、模型14周与模型18周间均有统计学差异(P<0.05，P<0.05)。预防组12周、预防14周、治疗肝癌组与相对应阶段模型组间均有统计学差异(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。结果见表1。
       2.4 血清NO含量检测模型组14周NO含量最低。12周预防组、12周模型组时NO含量与正常对照组间变化不大。各组与模型组14周比较均有统计学意义。结果见表1。表1 各组大鼠血浆中MDA、SOD、GSH-Px、NO的含量
       MDA中与模型组12周、14周、18周比较有显著性统计学差异，*P<0.01，**P<0.05。SOD中;与模型组12周比较，*P<0.01;分别与模型组12周、治疗肝硬化组、模型组14周、模型组18周比较均#P<0.05。GSH-Px中与模型组12周、模型组14周比较*P<0.05;与模型组18周比较,*P<0.01;与模型组18周比较，#P<0.0.5。NO中：与模型组14周比较，*P<0.01：与模型组14周比较，#P<0.05
       3 讨论
       肝癌是由肝炎病毒、黄曲霉毒素、二乙基亚硝胺等多病因作用，经启动、促进、演变多阶段的发病过程。这些致癌因素均可使瘤宿主体内自由基生成过多或/和清除不足，引起自由基含量的增高[1]。抗氧化能力是机体抵抗肿瘤的重要机制之一[2], 因此降低瘤宿主自由基水平可抑制或消除肿瘤的发生和发展。由于抗氧化酶半衰期短，有效浓度难以维持，因此人们设法从中医药方面去寻找抗氧化酶的替代物。
       体内氧自由基的增加及其引起的细胞膜脂质过氧化在创伤后肝功能损害中起重要作用[3]。MDA是脂质过氧化最终代谢产物，是反映体内脂质过氧化水平的敏感指标，它的含量的多少可反映机体内脂质过氧化的程度。本研究结果表明，DEN诱发的肝癌变过程中MDA水平逐渐增高;虎眼万年青总皂苷干预的与相对应模型组比较MDA表达水平降低，OCA-TS具有降低MDA生成作用。
       SOD是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应。正常生命过程中产生的超氧阴离子自由基是维持生命所必需的，当其浓度过高时，对机体会造成损害。因此SOD作为其特异清除剂，在生物体的生活动中具有重要意义。SOD活性低下可以看作是某些疾病的特征之一[4]。本研究结果表明，SOD在12周模型组显增高，提示SOD在促癌阶段活力显著增高，而在模型14周，模型18周组又趋于正常水平，可能是因为①癌前期细胞代谢旺盛，其细胞的线粒体和微粒体都有很大能力产生氧自由基，导致体内自由基代谢失衡。为了消除过多的自由基，达到动态平衡，机体消耗大量的抗氧化酶，从而导致酶活性下降;②细胞内产生的大量的氧自由基使DNA分子链断裂，硷基互换，继而引起基因突变及表达改变，致使酶蛋白合成不足或合成差错，导致抗氧化酶生成减少;③癌前病变时，在内、外源性的活性氧或自由基的作用下，一部分有活性的抗氧化酶转变为免疫学性质改变、酶活性下降或无活性的酶。虎眼万年青总皂苷作用组12周时与模型组二者间有统计学差异(P<0.05)，提示OCA-TS在肝癌前病变时降低氧自由基的产生，从而SOD活力低下。或者提示OCA-TS可以通过提高机体抗氧化酶的生物合成而增加酶活力来拮抗DEN引起的氧化损伤。这间接说明OCA-TS阻断肝癌前病变的作用之一是通过抑制自由基的形成。
       GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解的酶，是一种强抗氧化剂能清除脂质化氧化物，从而保护细胞免受氧化损伤，打断自由基引发的恶性循环。GSH-Px不仅能消除脂质过氧化物，打断自由基的链式反应，还能消除另一种自由基--过氧化氢。GSH-Px能够分解性质活泼的氧自由基，但分解后的产物——过氧化氢，仍然是一种对人体有害的自由基，还需要GSH-Px将它进一步分解成对人体无害的水和氧，此外，这种含硒酶还能消除羟自由基。羟自由基是一类活性很强的小分子，能与生物大分子作用，导致DNA降解、蛋白质失活、脂质过氧化，引起细胞癌变[5]。亚硝胺类的致癌机理是在其体内代谢活化生成自由甲基，攻击DNA分子，机体清除这类自由基主要依靠GSH-Px这种强大的抗氧化酶系统[6]。本实验结果显示GSH-Px中模型组12周、14周、18周时显著低于正常组，以模型18周时显著(P<0.05，P<0.05，P<0.01)，且模型12周、模型14周与模型18周间均有统计学差异(P<0.05，P<0.05)。这也提示①为了消除过多的自由基，达到动态平衡，机体消耗大量的抗氧化酶，从而导致酶活性下降;②癌变过程中，在自由基的作用下，一部分有活性的抗氧化酶转变为免疫学性质改变、酶活性下降或无活性的酶，且随病程进展愈加严重。虎眼万年青总皂苷干预的预防组12周、预防14周、治疗肝硬化组、治疗肝癌组与模型12周、14周、18周间均有统计学差异(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。可以看出在肝癌的促进、发生发展阶段GSH-Px始终起到作用。OCA-TS在肝癌的促进、发生发展阶段中能够增加大鼠血清GSH-Px的活力，提高大鼠DNA损伤修复能力，促进DNA损伤修复，提高抗氧化系统功能，降低对毒物的敏感性。
       NO存在于多种肿瘤细胞系和肿瘤组织中，NO对肿瘤的作用是双向的，这取决于NO的浓度、时间和效应部位以及癌组织内各种因子对NO的反应[7]，持续的低浓度可以促进肿瘤的发生发展，主要通过调节肿瘤增殖相关基因的表达、上调凋亡抑制基因Bcl-2等抑制肿瘤细胞的凋亡[8]、促进血管形成等。而高浓度的NO则通过干扰能量代谢、基因毒性、抑制蛋白合成、诱导凋亡等途径对肿瘤细胞产生毒性作用，阻断肿瘤新生血管形成而抑制肿瘤[9]。关于NO与肝病的研究较多，但因各自的研究方法、条件、标准的不同以及NO生物学活性的复杂性，所得出的结论出入较大，许多问题尚需进一步深入探讨。本研究结果提示在肝癌的发生发展过程中，血清中的NO浓度模型组14周时表达量最低，与各组间均有显著性差异。可能是因为此阶段正处于肝癌变阶段，低浓度的NO促进肿瘤的发生发展。OCA-TS作用组14周时NO量明显升高，且与14周模型组具有显著性差异。OCA-TS在肝癌发生阶段提升NO浓度，防止肝癌的发生。
       虎眼万年青主要抗肿瘤成分皂苷OSW-1特异地作用于肿瘤细胞线粒体，促进肿瘤细胞凋亡[10]。而自由基主要由线粒体和微粒体产生，导致体内自由基代谢失衡。本研究提示OCA-TS具有干预自由基产生及抗氧化作用，抑制肝损伤硬化、肝癌的发生发展。能否成为抗氧化酶的替代物，待进一步深入研究。
       【参考文献】
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       [4] 丁书茂，杨 旭.超氧化物歧化酶及其模拟化合物研究进展[J].高等函授学报(自然科学版)，2004，17(1):1.
       
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