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       【摘要】 
       目的探讨宫内缺氧对幼年大鼠海马CA3区神经元与学习能力的影响，以及NMDAR1 mRNA在其新生期的表达与当归的调控作用。方法健康SD孕鼠30只，随机分为对照组、缺氧组和当归组各10只，于孕14 d开始将缺氧组与当归组孕鼠用三气培养箱制作胎鼠宫内缺氧模型，当归组用250 g/L当归静脉注射干预。3组孕鼠分娩当日每窝随机选取新生鼠2只，取脑、常规石蜡切片;余新生鼠随机选取2只喂养至30 d进行Morris水迷宫测试，测试结束当日，多聚甲醛灌注固定取脑、常规石蜡切片。幼鼠脑组织作NSE mRNA原位杂交、新生鼠脑组织作NMDAR1 mRNA原位杂交。结果Morris水迷宫实验和NSE mRNA原位杂显示：与对照组(n=20)相比，缺氧组幼鼠(n=20)空间探查测试和对位探查测试时间较缩短、海马CA3区阳性细胞数减少(P<0.05)，当归组(n=20)探查测试时间较缺氧组延长(P<0.05)、海马CA3区阳性细胞数增多(P<0.05);NMDAR1 mRNA原位杂交显示：与对照组相比，缺氧组海马CA3区阳性细胞积分光密度值增大，当归组较缺氧组减小(P<0.05)。结论宫内缺氧可致新生大鼠海马CA3区NMDAR1 mRNA表达增高，从而使幼年大鼠该区神经元减少，学习记忆能力降低，而当归注射液可改善宫内缺氧状态，增加幼年大鼠海马CA3区神经元数量，提高其学习记忆能力。
       【关键词】  海马; 学习能力; N-甲基-D-天门冬氨酸受体1; 缺氧; 当归
       Effect of Angelica Sinensis on Hippocampal CA3 Area Neurons and Learning Capacity of Juvenile Rats Following Intrauterine Hypoxia and its Mechamism
       HE Yan, ZHAO Feng, MA Jing, YU Hong*
       (Department of Histology and Embryology，Luzhou Medical College，Luzhou, Sichuan 646000, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the effect of intrauterine hypoxia on hippocampal CA3 area neurons and learning capacity of juvenile rats,and to explore the expression of N-methy-D-aspartate receptor-1(NMDAR1) in hippocampal CA3 area of neonatal rats following intrauterine hypoxia and the regulatory mechanism of Angelica sinensis. MethodsThirty healthy pregnant SD rats were divided randomly into control group, hypoxia group and Angelica group. Hypoxia group and Angelica group pregnant rats were made the intrauterine hypoxia model of fetal rats with the three-gas incubator from the beginning of pregnant 14th day, and the rats of Angelica group were intervened with Angelica sinensis injection. After birth,two neonatal rats were selected randomly from each litter to take the brain tissue, make paraffin sections conventionly.Two neonatal rats were selected again randomly from the others in each litter to perform of Morris water maze after the 30th day of birth, and perfused paraformaldehyde at the end of the last day,took the brain tissue of juvenile rats, and paraffin sections conventionly. The expression of NSE mRNA and NMDAR1 mRNA were detected by using in site hybridization.ResultsIn hypoxia group juvenile rats(n=20),the searching time of probe trial and reveral probe trial in the target quadrant, and the quantity of positive NSE mRNA cells in hyppocampal CA3 area were less than that of control group(n=20) (P<0.05);and that of Angelica group(n=20) was more than that of hypoxia group (P<0.05).The integral optical density(IOD) value of positive NMDAR1 mRNA cells in hippocampal CA3 area in hypoxia group neontal rats(n=20) was significantly higher than that of control group(n=20) and also higher than that of Angelica group(n=20) (P<0.05).ConclusionIntrauterine hypoxia can increase the expression of NMDAR1 mRNA in hippocampal dentate gyrus of neontal rats, thus reduced the quantity of hippocampal dentate gyrus neurons and learning-memory capacity of juvenile rats,while Angelica sinensis injection can improve the intrauterine hypoxic condition, thus increase the quantity of hippocampal dentate gyrus neurons and learning-memory capacity of juvenile rats.
       Key words：Hippocampus; Learning capacity; NMDAR1; Hypoxia; Angelica
       宫内缺氧是胚胎发育中的常见症状，多种疾病可引起胚胎宫内缺氧。神经系统在胚胎发育中出现最早，其细胞对缺氧极为敏感。因此，研究缺氧及药物对神经系统的影响具有重要的临床意义。已有研究证实当归对一定时间、一定氧浓度宫内缺氧脑组织有一定保护作用[1]，王东红等[2]研究发现宫内缺氧可致生后小鼠发育期顶叶皮质神经元数量明显减少，并可引起成年小鼠学习记忆能力降低，但其宫内缺氧模型较原始。目前，关于当归调控宫内缺氧后海马NMDAR的表达与神经元和学习能力关系的研究未见报道。本实验采用改良的大鼠宫内缺氧动物模型、Morris水迷宫实验和NMDAR1 mRNA固相原位杂交方法在此方面进行研究，为宫内缺氧对神经系统的远期影响及可能机制提供理论基础。
       1 材料与仪器
       1.1 试剂与仪器大鼠NSE mRNA、NMDAR1 mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程公司; 250 g/L的当归注射液(批号：070823)购自武汉大学中南医院。三气培养箱购自美国REVCO COMPANY;切片机购自德国Leica COMPANY;Morris水迷宫跟踪系统购自成都泰盟公司。
       1.2 动物分组30只成年孕14 d的SD雌大鼠(由泸州医学院动物实验中心提供，一级合格动物，许可证号：川实动管质第17号)随机分为对照组、缺氧组和当归组各10只。
       2 方法
       2.1 宫内缺氧动物模型参照本实验小组前期制作的宫内缺氧模型[3]，但延长缺氧时间。当归组孕鼠自孕14 d开始，每天下午2：00经尾静脉注射250 g/L的当归注射液8 ml/kg，1 h后放入设置好的三气培养箱(氧体积分数130 ml/L，温度25℃ ，二氧化碳体积分数0.4～0.6 ml/L)内缺氧2h，连续缺氧5 d(孕第14～18天)。第19天、20天仍给予当归注射，但不缺氧。缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组。对照组不缺氧，余同缺氧组。
       2.2 新生鼠处理各组孕鼠待其自然分娩(每只孕鼠产仔鼠5～8只)，产后每窝随机取新生鼠2只(每组得新生鼠20只)，在前囟后约1 mm处取脑、40 g/L多聚甲醛固定40 min、常规脱水石蜡包埋(试剂中均含1 g/L的DEPC)、经海马冠状切面切片(厚5 μm)，取组织块中肉眼可见海马后的第20张切片备用。每窝剩余新生鼠随机选取2只喂养至30 d(每组得幼鼠20只)。
       2.3 Morris水迷宫实验将30日龄的幼年大鼠进行11 d的水迷宫测试。具体参照Morris水迷宫实验方法[4]。四象限阶段训练，每象限间隔10 min，若训练时下水时间达60 s仍未找到平台，则引导大鼠到平台，让其在平台上停留10 s，连续训练5 d，第6天(35日龄)行无平台60 s的空间探查测试，记录在目标象限的探查时间T1。第7天开始维持4d的对位训练，训练方法同前，仅平台移至对侧象限，第11天(40日龄)进行60 s的无平台对位探查测试，记录在目标象限的探查时间T2，实验中保持每次实验室环境不变。
       2.4 幼鼠取材幼鼠于水迷宫测试结束当日(40日龄)经40 g/L多聚甲醛灌注固定1 h、在前囟后约3 mm处取脑、后固定1h，DEPC水洗涤，梯度酒精脱水(以上液体均含1 g/L的DEPC)。常规石蜡包埋，经海马冠状切面切片(厚5 μm)，取组织块中肉眼可见海马后的第50张切片备用。
       2.5 原位杂交、照相新生鼠脑组织切片作NMDAR1 mRNA原位杂交，幼鼠脑组织切片作NSE mRNA原位杂交，步骤按说明书进行(其中胃蛋白酶消化时间为6min)，DAB避光显色5～10min(镜下控制显色时间)，切片常规脱水、透明、封片。每张切片在400×下用OLYMPUS Ax-70显微成像系统(日本OLYMPUS光学仪器有限公司)对海马CA3区拍照。
       2.6 图像分析及统计学处理采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统(Media Cybernetics公司软件)，对每张NSE mRNA的400×图片均在海马CA3区锥体细胞层相同区域选取相同大小面积进行图像分析，统计其阳性细胞数量;各NMDAR1 mRNA的400×图片在海马CA3区相同区域(包括分子层、锥体细胞层和多形细胞层)选取相同大小面积进行图像分析，统计阳性细胞的IOD值。数据以±s表示，采用SPSS13.0软件包进行单因素方差分析。
       3 结果
       3.1 Morris水迷宫结果缺氧组幼鼠空间探查测试时间(T1)和对位探查测试时间(T2)，较对照组缩短，而当归组T1和T2较缺氧组延长(见表1)。表1 3组幼年大鼠Morris水迷宫测试T1和T2比较与对照组比较，#P<0.05;与缺氧组比较，▲P<0.05;n=20
       3.2 各组幼鼠海马CA3区NSE mRNA的表达NSE mRNA原位杂交阳性细胞胞质染为棕黄色，以胞体着色为主, 阳性细胞主要集中在海马皮质锥体层。对照组CA3区阳性细胞染色深，阳性细胞数多而密集(见图1);缺氧组海马CA3区阳性细胞染色减弱，数量明显减少，细胞稀疏，锥体细胞层变窄(见图2);当归组CA3区阳性细胞染色变深，细胞数量增多，锥体细胞层变宽，但细胞不如对照组紧密(见图3)。各组NSE mRNA阳性细胞数比较见表2。
       3.3 各组新生鼠海马CA3区NMDAR1 mRNA的表达NMDAR1 mRNA原位杂交阳性细胞胞质染为棕黄色，海马CA3区三层均可见阳性细胞，但以锥体细胞层为主。对照组CA3区锥体层阳性细胞密集、染色浅，分子层和多形细胞层的阳性细胞较稀疏(见图4);缺氧组CA3区阳性细胞染色明显加深，分子层和多形细胞层也有较多阳性细胞(见图5);当归组CA3区分子层和多形细胞层仍有较多阳性细胞，但各层阳性细胞染色较缺氧组明显减弱(见图6)。各组新生鼠海马CA3区NMDAR1 mRNA阳性细胞的IOD值见表2。
       4 讨论
       已有研究表明，学习记忆的结构基础是大脑边缘系统，特别是海马CA3区，是动物形成空间辨别性学习记忆过程的重要结构。在此结构中，海马CA3区神经元又是参与学习记忆功能的重要细胞，因此，该区域神经元数量、形态结构与功能的变化必然导致其学习记忆能力的变化。本实验原位杂交结果发现缺氧组幼鼠海马CA3区NSE mRNA阳性细胞(NSE是神经元的特异性标记物)数量较正常对照组减少，而当归组NSE mRNA阳性细胞数量较缺氧组升高;同时Morris水迷宫实验发现缺氧组幼鼠学习记忆能力降低，而当归组幼鼠的学习记忆能力增强结合各组学习记忆能力的变化。结果表明，宫内缺氧可导致幼鼠海马CA3区神经元的减少、学习记忆能力的降低;而当归注射液可增加宫内缺氧大鼠在幼年期海马CA3区神经元的数量、提高幼鼠学习记忆能力。表2 各组幼鼠NSE mRNA阳性细胞数与新生鼠NMDAR1 mRNA阳性细胞的IOD值
       研究表明,N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methy-D-aspartate receptor,NMDAR)是中枢神经系统兴奋性氨基酸谷氨酸的离子型受体，包括NMDAR1和NMDAR2两个亚基，前者是功能亚基，后者是调节亚基[5]。由于NMDAR1的分布和含量可以代表NMDAR的分布和含量，本实验仅对NMDAR1 mRNA的表达进行检测。而NMDAR被认为是学习记忆形成和维持的关键物质，它可调控神经元的存活或死亡，树突、轴突结构发育及突触可塑性，影响神经元回路的形成[6]。NMDAR是海马、皮层长时程增强(1ong-term potentiation，LTP)形成和维持的关键，通过与其配体谷氨酸结合，引起由G蛋白介导的一系列反应，包括Ca2+内流、激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶、PKC和酪氨酸激酶(PTK)通路等，共同作用产生LTP，而LTP是中枢神经系统可塑性的一种模式，是记忆形成和巩固过程中神经元活动的客观过程和指标[7]，其中NMDAR调节的钙离子内流对Ca2+ 的通透性比Na+、K+ 高10倍[8]，从而保持神经元正常的生理功能，在LTP的诱导和维持、空间记忆形成以及新记忆向长时记忆的转化中发挥非常重要的作用[9]。本实验中对照组新生大鼠NMDAR1 mRNA也有较高水平的表达，这是其维持幼年期正常的学习记忆能力的基础。
       同时实验结果也表明，胚胎晚期的宫内缺氧明显上调了新生大鼠NMDAR1 mRNA的表达。既往国内外的研究结果表明，持续刺激谷氨酸的NMDAR可产生神经毒性效应[10]，是神经退行性疾病的重要机制[11]，发育期脑受到多种兴奋毒性病理因素如缺血缺氧、惊厥等损伤后不仅在急性期会影响NMDAR的表达和功能，而且可以引起远期NMDAR的结构和数量发生改变，使得脑的兴奋性异常，从而对脑发育产生长期影响[12，13]。因为NMDAR参与学习记忆、突触发育的可塑性过程，其表达增加、活性增高后必然对其介导的反应产生增强作用，增强兴奋性突触传递，干扰LTP的形成并导致神经网络突触重建，还可通过c-fos等基因的表达上调caspase -3、NF-KB等活性物质，从而诱导神经元凋亡、脱失，最终引起学习记忆功能障碍[14]。因此，本实验中缺氧组幼年大鼠海马CA3区神经元数量的减少，可能是由于宫内缺氧后其急性期新生大鼠NMDAR1 mRNA的表达增加所引起的远期效应，从而减弱了幼鼠的学习记忆能力。
       由此可见，胚胎期或新生期机体脑内NMDAR较成体较高的表达是脑发育中形成学习和记忆及神经系统可塑性所必需的;但当损伤因素存在时NMDAR的过高表达又可损伤神经系统。因此，研究发育中脑损伤，尤其是损伤保护，必须重视NMDAR表达的“双刃剑”作用，既要想办法抑制损伤时NMDAR的过度增高，又要维持脑发育所必需的一定量的NMDAR表达，而不能简单地使用NMDAR阻断剂完全阻断NMDAR的表达。因此在治疗上，中药表现得更具有可行性。
       本实验中，在使用当归注射液之后明显下调了新生鼠CA3区NMDAR1 mRNA的表达，但仍维持较高水平，结合该组幼鼠海马CA3区NSE mRNA的表达和水迷宫实验结果，可见当归注射液既抑制了脑兴奋性的过度增高，又维持了脑发育所必需的一定高兴奋性，防止了神经元的凋亡、脱失，从而保证了学习记忆能力的形成和维持，反映在该组大鼠在幼年期海马CA3区NSE mRNA阳性细胞的增多，学习记忆能力的增强。当归有效成分，如藁本内酯、当归多糖、当归挥发油、氨基酸、微量元素等[15，16]具有抗血小板聚集和血栓形成、扩血管、清除氧自由基等作用[17，18]，藁本内酯可通过减小氧化应激和抗细胞凋亡来保护缺血再灌注损伤对大脑的伤害，此外藁本内酯可增加缺血损伤小鼠大脑皮层原癌基因Bcl-2的表达，同时降低Bax和caspase-3的表达[18]。研究表明妊娠期高血压可致患者外周血管内皮祖细胞数量减少、功能减退[19]，而当归注射液对损伤的血管内皮有保护作用[20]。Kang等[21]研究发现当归属的根中提取得到的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神经保护作用，通过多种机制减少过度活化的NMDAR引起的Ca2+内流，降低NMDA引发的细胞毒作用。可见当归注射液通过下调缺氧后NMDAR1 mRNA的表达，从而减弱NMDAR1高表达对神经元的损伤，从而改善宫内缺氧后幼年大鼠的学习记忆能力。
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