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       【摘要】 
       目的探讨附子回阳救逆功效的量效关系，为临床安全用药提供客观实验依据。方法制备附子供试药液，测定酯型生物碱乌头碱含量、半数致死量，筛选附子有效剂量范围，分别测定失血性休克大鼠模型平均动脉压(MAP)、心率(HR)，心动过缓小鼠模型HR，统计实验数据绘制量效关系曲线，线性回归分析附子不同剂量与相应实验指标的相关性。结果附子供试药液酯型生物碱乌头碱的含量为0.036 4%，LD50=31.24 g/kg;附子能显著扩张血管升高MAP，加快HR，在0.5～6 g/kg剂量范围内，剂量与其升高MAP作用呈正相关，在0.5～4 g/kg剂量范围内，剂量与其加快HR作用呈正相关;附子能显著对抗心动过缓，在0.72～2.89 g/kg剂量范围内，剂量与其对抗普萘洛尔所致心动过缓作用呈正相关。结论附子回阳救逆功效显著，且在一定剂量范围内存在量效关系，一旦超出相应剂量范围动物易出现毒性反应，影响实验动物存活率，提示附子临证用药的可能安全范围为5.56～44.44 g/d。
       【关键词】  附子; 回阳救逆; 量效关系; 相关性
       The Experimental Study on Dose-Effect Relationship of Chinese Medicine Prepared Aconite Root on Effect of Reviving the “Yang” for Resuscitation
       DENG Jia-gang1, FAN Li-li1, HAO Er-wei2, LIU Jun-hui1
       (1.Faculty of Pharmacology, Guangxi Traditional Chinese Medical University, MingxiuDong Rd 179.Nanning, Guangxi, 530001, China; 2. School of Basic Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan, Shandong, 250355, China)
       Abstract：ObjectiveTo inquire the dose-effect relationship of Chinese medicine prepared aconite root (PAT) on the effect of reviving the "Yang" for resuscitation, and to provide the experimental basis for security administration.MethodsPAT were extracted with the water decoction-alcohol sedimentation method. We measured LD50 and the content of ester type alkaloid. We built hemorrhagic shock model in rat with fleetness bloodletting method and measured the MAP、HR. We built Bradycardia model in mouse with irrigating the stomach giving overdose propranolol and measured the HR.ResultsThe result of acute toxicity testing was LD50=31.24 g/kg and he content result of ester type alkaloid was 364 μg/g. There was direct correlationship between dose of PAT and effect of increasing MAP in hemorrhagic shock rats within 0.5～6g/kg dose range. There was direct correlationship between dose of PAT and effect of increasing HR in hemorrhagic shock rats within 1～4g/kg dose range. There was direct correlationship between dose of PAT and effect of increasing HR in Bradycardia mice within 0.72～4.33g/kg dose range.ConclusionThe effect of reviving the "Yang" for resuscitation was notable and showed dosage-effect relationship. The conclusion from these experiments can hint the range of 5.56～44.44 g/d as clinic dose range, or toxicity become apparent.
       Key words： Prepared aconite root; Reviving the "yang" for resuscitation; Dose-effect relationship
       附子有“回阳救逆第一品药”之称，与人参、熟地、大黄并称为“中药四维”，是临床常用的中药之一。但同时附子“毒”与“效”的矛盾在临床实践中一直困扰着历代医家，有“最有用而最难用当推附子”之说：有医家坚持“附子大毒，不可用，非用必小”，不可贸然用之;而另有以“火神派”为代表的医家认为“附子为百药之长”，“量小无效”，须重用。目前困惑临床医生的是附子大剂量应用有无必要，是否可行。笔者选用附子完成其回阳救逆功效的实验研究，探讨其量效关系，为临床安全用药规范提供实验依据，进而为中药剂量与功效的相关性研究提供客观实证参考。
       1 材料与仪器
       1.1 动物昆明种小鼠，清洁级，雌雄兼有，体质量(28±2)g ，(20±2)g，由广西医科大学实验动物中心提供(SCXK桂2003-0003)。SD大鼠，清洁级，雌雄兼有，体质量(250±20)g，广西药品检验所实验动物中心(SCXK桂2003-0001)。
       1.2 药物附子，购自四川省成都市荷花池药材市场，经广西中医学院中药鉴定教研室鉴定为毛茛科植物乌头Aconitmn Carlnicadi Debx.的子根加工炮制品，采用水煎2次，每次1 h，1∶2乙醇醇沉，减压浓缩，配置成4 g/ml冰箱保存;乌拉坦：上海试剂三厂;普萘洛尔：湖北华中药业有限公司生产;氢化可的松注射液：扬州制药有限公司生产，规格：5 ml∶25 mg;肝素钠注射液：江苏万邦深化医药股份有限公司生产，规格：2 ml∶12500单位。
       1.3 仪器医用压力传感器，中国北京航天医学工程研究所生产;BL-410生物机能系统，成都泰盟科技有限公司生产;EL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅，国华电器有限公司生产; lambda系列紫外/可见分光光度计,美国PerkinElmer公司生产;TGL-16M低温超速离心机，湖南塞特湘仪有限公司生产。
       2 方法
       2.1 酯型生物碱乌头碱的含量测定附子供试药物中酯型生物碱含量的测定方法依《中国药典》2005版制定[1]。
       2.1.1 对照品溶液制备精密称取乌头碱对照品20 mg，置于10 ml容量瓶中，用无水乙醇溶液并稀释至刻度。
       2.1.2 标准曲线制备精密量取对照品溶液0.25，0.50，1.0，1.5，2.0 ，2.5 ml，分别置25 ml量瓶中，均无水乙醇使成2.5 ml，各精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 ml，摇匀，在60～65℃水浴中保温10 min，放冷，加高氯酸铁试液13 ml，摇匀，放置5 min，精密加入高氯酸试液8 ml，用高氯酸铁试液稀释至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法在520 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
       2.1.3 测定法精密量取样品10 ml，低温蒸干。残渣加三氯甲烷2 ml使溶解，转入分液漏斗中，用0.05 mol/L硫酸溶液提取3次，每次5 ml，酸液依次用同一三氯甲烷10 ml振摇洗涤，合并酸液，加氨试液调节pH值至9，再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml。三氯甲烷液依次用同一水20 ml振摇洗涤，合并三氯甲烷液，低温蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转入5 ml量瓶中，用无水乙醇分次洗涤容器，洗涤液并入量瓶中，再加无水乙醇至刻度，摇匀。精密量取上述溶液及无水乙醇空白溶液各2.5 ml，分别置25 ml量瓶中，照“2.1.2”标准曲线的制备项下的方法，各“各精密加入碱性盐酸羟胺试液1.5 ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中酯型生物碱乌头碱的重量(μg)，计算，即得。
       2.2 附子急性毒性实验
       2.2.1 预试验昆明种小鼠20只，体质量(20±2)g，随机分成5组，每组4只，选择5组剂量的中药附子水煎醇沉液，每只小鼠以0.4 ml样品溶液进行灌胃，观察小鼠出现中毒反应的症状并记录死亡数，分别找出各样品Dm值(100%死亡量)与Dn值(0%死亡率)。
       2.2.2 正式实验昆明种小鼠50只，体质量(20±2)g，雌雄各半，按体质量和性别随机分成5个组，每组10只，以Dm和Dn值，根据分组及剂量比值公式确定组间剂量比值，配成5种浓度，每只0.4 ml灌胃给药，给药后观察7 d，观察和记录有无异常反应和死亡情况，计算LD50。
       2.3 附子剂量对失血性休克大鼠MAP和HR的影响[2]SD大鼠，清洁级，雌雄各半，体质量(250±20)g。大鼠称重，腹腔注射乌拉坦麻醉后，仰卧固定四肢，尾静脉全身肝素化。接好心电图II导联，连接BL-410生物机能系统检测HR。大鼠行右颈总动脉插管，接换能器以监测MAP。分离十二指肠以备给药。在20 min内放血至MAP 35～40 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，稳定不再回升即为放血终点，记录HR值。随机分为空白对照组、模型对照组、附子各剂量组，每组10只。于十二指肠分组给药，对照组给等量生理盐水，观察记录MAP值和HR值。
       2.4 附子剂量对心动过缓小鼠HR的影响[3]昆明种小鼠，(28±2)g，心电图筛选HR为540～780次/min用于实验，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、附子各剂量给药组，共8组，每组12只。小鼠灌胃给予普萘洛尔药液(80 mg/kg)造模。空白对照组及模型对照组10 min后腹腔注射生理盐水(10 ml/kg)，各给药组则腹腔注射不同浓度的附子水煎醇沉液(10 ml/kg)。各组小鼠均在给予普萘洛尔后30 min再次测定HR，记录各组数据。
       2.5 统计数据方法所有定量指标均用 ±s表示，采用SPSS 11.5统计软件处理数据，进行组间比较及线性回归分析，同时绘制量效曲线，计算量效方程。
       3 结果
       3.1 酯型生物碱乌头碱含量的测定广西自治区食品药品检验所中药室测得：本实验供试药物中酯型生物碱乌头碱(C34H47NO11)含量为0.036 4%。
       3.2 急性毒性实验给药后即有动物出现中毒症状：躁动不安、呼吸增强、头部颤动继而全身抽搐，继而蜷卧，体表温度下降，直至死亡。解剖发现中毒死亡小鼠肝脏、肾脏呈暗红色，心脏有轻微淤血，内有少量积液，其余未见异常。实验结果见表1。LD50=31.24 g/kg(95﹪可信空间：21.35～45.71 g/kg)，换算成人临床用量为240.31 g/d。表1 附子供试药液急性毒性实验的实验结果
       3.3 附子不同剂量对失血性休克大鼠MAP和HR的影响
       3.3.1 失血性休克大鼠的一般情况大鼠行颈总动脉插管快速放血后，MAP迅速下降到35 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)，停止放血待MAP稳定，一般控制在35～40 mmHg，此时大鼠HR减慢，呼吸频率减慢幅度加深。实验过程中，模型组动物未出现MAP回升且持续下降，呼吸急促减弱直至死亡，2 h后存活率为0%。而除0.25 g/kg剂量组外，附子其余各剂量组2 h均有存活;4，5 g/kg剂量组存活率为100%;6 g/kg剂量组给药后动物出现MAP升高但伴随心律失常，2 h存活率有所下降。见表2。
       3.3.2 附子不同剂量对失血性休克大鼠MAP增长率和HR增长的影响实验结果显示，颈总动脉插管快速放血模型组与假手术对照组比较，MAP急剧下降，心电图II导联显示HR减慢，提示大鼠快速失血造模后全身有效血容量急剧下降，代偿机能已开始衰竭，出现不可逆性休克。与模型组比较，附子给药组经十二指肠给药后，MAP出现短时间迅速升高，计算MAP增长率发现，中药附子各剂量组与模型组之间比较存在差异(P<0.05)，其中1，2，3，4，5，6 g/kg剂量组与模型组比较存在显著性差异(P<0.01)。大鼠HR短时间亦有所恢复，计算HR增长值发现，中药附子各剂量组与模型组之间比较存在差异(P<0.05)，其中剂量0.5，1，2，3，4，5，6 g/kg剂量组与模型组之间比较存在显著性差异(P<0.01)，见表2。
       绘制量效关系曲线图显示，在0.5～6 g/kg剂量范围内，附子能显著增加失血性休克大鼠MAP增长率，附子剂量与失血性休克大鼠MAP增长率之间的线性关系方程为Y=11.936X+42.24，R=9263(Y为MAP增长率，X为附子剂量，R为相关系数)。在0.5～4 g/kg剂量范围内，中药附子能显著增加失血性休克大鼠HR增长值，附子剂量与失血性休克大鼠HR增长值之间的线性关系方程为Y=14.011X+18.466，R=0.865 7(Y为HR增长，X为附子剂量，R为相关系数)。由此可以推断，在0.5～6 g/kg剂量范围内，附子剂量与其升高MAP作用呈良好正相关;在0.5～4 g/kg剂量范围内，附子剂量与其增加HR作用呈正相关。见图1～2。
       图1 附子不同剂量(0.5～06g/kg) 图2 附子不剂量(0.5～4g/kg)
       对失血性休克大鼠MAP 对失血性休克大鼠HR
       增长率的影响 增长的影响
       3.4 附子不同剂量对心动过缓小鼠HR的影响与空白组比较，灌胃给予过量普萘洛尔后，实验小鼠均出现身体蜷缩，行动迟缓，体表及四肢温度明显下降等一系列症状，模型组小鼠给予普萘洛尔30 min后存活率为83.33%，90 min后存活率仅为25%。给予普萘洛尔30 min后，5.78，7.22 g/kg剂量组，在给药30 min出现部分小鼠出现死亡，存活率分别为91.67%，58.33%，给药90 min存活率分别为41.67，0%。见表3。
       统计结果显示，造模后模型组小鼠HR降低，与空白组比较存在显著性差异(P<0.01);附子5.78 g/kg剂量组与模型组之间比较存在差异(P<0.05);附子1.44，2.89，4.33，5.78g/kg剂量组与模型组之间比较存在显著性差异(P<0.01)。结果见表3。
       绘制量效关系曲线显示：附子各剂量给药组给药后均具有对抗普萘洛尔减慢HR的作用，且此效应在0.72～2.89 g/kg范围内呈剂量依赖关系，附子剂量与心动过缓小鼠HR影响的线性关系方程为Y=27.626X+320.92，R= 0.9856(Y为HR，X为附子剂量，R为相关系数)，从实验结果可以看出附子剂量与其对抗普萘洛尔所致心动过缓作用呈良好正相关。见图3～4。表2 附子不同剂量对失血性休克大鼠MAP增长率和HR增长的影响与空白组比较，*P<0.05，** P<0.01;与模型组比较，◆P<0.05，◆◆ P<0.01;n=10表3 附子不同剂量对心动过缓小鼠存活率与HR的影响
       4 讨论
       古今医家对中药的量效关系极其重视，一致认为中药的量效关系是数千年来古人以生命为代价而获得的实践经验，是中医的用药精华，而医者对量效关系的把握是否得当直接影响到临床疗效与用药安全。目前临床报道发现，小部分医者临证用药只注重量效关系的常规性，而忽视其特殊性，导致中药剂量偏大，不良反应日趋严重[4，5]，可见剂量问题成为有效避免不良反应的关键，中药的量效关系研究就显得尤为重要。
       附子有“回阳救逆第一品药”之称，被广泛用于临床且收效非凡。现代药理研究亦证实，附子能加强心血管循环、扩张血管、增强心肌收缩力、加快心率、增加心排出量和冠状动脉血流量等。然而附子功效卓著却有毒，中医药业内目前还没有能够同时控制毒性和保证疗效的炮制工艺规范，也没有能够表明附子安全性和有效性的量化的科学质量标准，这也就导致在确定附子临证剂量的时候并无相对科学的依据。现行的相对比较科学的标准是采用传统的工艺炮制与现代技术相结合，利用现代检测手段来检测、控制酯型生物碱乌头碱的含量。本实验为进一步的附子量效关系实验研究提供量化的科学依据，测定供试药液中酯型生物碱乌头碱含量为0.036 4%，并将此实验结果引进到下一步临床研究中，并以此对供试药物进行客观评价。
       通过绘制附子量效关系曲线显示，在一定范围内，其回阳救逆功效随剂量增大而增强，且呈良好线性关系，但同时显示效应达到最高处时并不再随剂量增大而增强，此时量效关系曲线发生起伏，观察记录实验动物一般生理状态高剂量组伴随有中毒反应发生，剂量持续增加反而降低动物的存活率，提示附子临床可能有效剂量范围为5.56～44.44 g/d，超出此范围回阳救逆功效并未有效增强，反而毒性反应明显，用药安全无法保证，同时增加患者医疗成本，不利于中药附子规范化用药的实现。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：27.
       
       [2] 邵春红，王晓良.四逆汤对失血性休克大鼠心功能和血压调节的肾上腺素受体机制研究[J].中国药学杂志，2003，38(11)：847.
       
       [3] 谢秋心，韦颖梅，祝晓光，等.桂龙增脉饮抗心率减慢药效动力学实验研究[J].蚌埠医学院，1994，19(2)：105.
       
       [4] 吴莉佳，曹 蓓.中药不良反应原因探讨[J].现代医药卫生，2007，23(12)：1838.
       
       [5] 王光明，王志高.中药不良反应的成因与对策[J].四川中医，2007，25(4)：35.