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       【摘要】 
       目的优选滇桂艾纳香中氨基酸的提取纯化工艺。方法采用不同的溶剂提取法,考察不同吸附时间、不同的pH值、洗脱剂种类、洗脱剂浓度对717阴离子树脂性能的影响。结果超声波辅助水提取得到较高的氨基酸提取率为0.220%,吸附时间6h,在提取液pH=12时上柱,用氯化铵梯度洗脱,氨基酸的收率可达87.11%，氨基酸纯度达到92.12%。结论该工艺条件回收率高且稳定达到了理想的实验效果。
       【关键词】  氨基酸; 提取纯化; 717阴离子交换树脂
       Technological Research on the Extraction and Purification of Amino Acids from Blumea riparia (BL.)DC
       LI Qian1, HUANG Li1, LIN Cuiwu2*, WEI Baoyao1**, TENG Jianwen1
       (1. The Institute of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China;
       2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China)
       Abstract：ObjectiveTo optimize a technical process for extraction and purification of amino acids from Blumea riparia (BL.)DC. MethodsDifferent solvents were used to extract amino acids and the effects of different absorption time, pH，eluate and eluate concentration on 717 anion exchange resin were studied.ResultsThe extraction yield of amino acids was 0.220% by ultrasonic wave water extraction.The yield of amino acids was 87.11%and the purity was 92.12% under the condition of absorption time 6h， pH =12，NH4Cl gradient elution.ConclusionThis method is efficient，stable and reasonable.
       Key words：Amino acids; Extraction and purification; 717 Anion exchange resin
       滇桂艾纳香Blumea riparia(BL.)DC，在《中国植物志》里亦有收载，称假东风草[1]，民间习用全草入药。《中华药海》中记载，滇桂艾纳香性味归经:淡、甘平，入肝、肾、膀胱三经;功效主治活血止血——本品甘淡入肝，养肝活血，收敛止血，具有活血不伤血、止血不留淤之功，可用于各种出血症;利水消肿——本品甘淡渗利，可利湿行水，主治小便不利浮肿症，用其性平、无寒热、偏热颇，故寒症、热症可用之，尤对产后浮肿症佳。起活血养血、利水消肿之效[2]。《新华本草纲要》中亦提到其有活血、止血、利水的功能，用于治经期提前，产后血崩，产后浮肿，不孕症[3]。
       滇桂艾纳香提取物的强极性部分富含氨基酸成分。氨基酸类化合物是一类重要的天然产物，广泛存在于动植物中[4]。有构成生物有机体的蛋白质氨基酸，和非蛋白质氨基酸，都具有多种生理活性，在医药及食品产业方面都有广泛的应用[5]。随着研究的深入，其种类也日趋增多， 1981年日本小菅卓夫首次从三七中分得了三七素，一种特殊的氨基酸β-N-乙二酸酰基-L-α，β-二氨基丙酸(β-N-oxalo-L-α,β-diaminopropionic acid) 具有缩短出血和凝血时间，有止血活性[6]。在临床术后常用的止血氨基酸,有止血芳酸、止血环酸和6-氨基已酸等，它们的结构类似赖氨酸，可以和纤溶酶(原)上的赖氨酸位点结合。从而阻止纤溶酶(原)与纤溶蛋白(原) 的结合，防止纤溶酶原激活和纤溶酶的破坏作用，减少纤维蛋白降解产物(FDP)和 D-二聚体的产生，可间接保护血小板功能，起到止血作用[7]。
       目前主要对滇桂艾纳香地上部分的化学成分进行研究，集中在挥发性化学成分，有机酸，黄酮类物质[8～14]。未见对其氨基酸成分的研究报道，由于滇桂艾纳香与三七都具有止血化淤功效，而滇桂艾纳香的药理作用机理尚未明确，本文对滇桂艾纳香进行不同溶剂提取，717阴离子交换树脂富集纯化氨基酸，旨在进一步揭示其药效物质基础，为其进一步研究提供一定的科学依据。
       1 材料与仪器
       滇桂艾纳香全草干草(广西桂西制药厂提供)。超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司SK3310LHC);紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司SP-756P)。717阴离子交换树脂(三星树脂科技有限公司);谷氨酸对照品(上海昊化化工有限公司)。
       2 方法
       2.1 氨基酸含量的测定采用国标GB/T 8314-2002 茶 游离氨基酸含量测定方法，用谷氨酸标准品。
       2.2 游离氨基酸的提取及提取率测定分别采用50%乙醇，70%乙醇，水，80℃回流提取，及超声辅助水提法。提取率按以下公式计算: A=C/B×100%，A为提取率 ( % )，B为原药料质量 ( g)，C为提取得氨基酸质量 ( g)。
       2.3 树脂的预处理及总交换容量的测定717阴离子交换树脂用过量的蒸馏水浸泡后，经1 mol/L氢氧化钠和1 mol/L盐酸重复处理后，最后再用1 mol/L氢氧化钠浸泡，用蒸馏水洗至中性备用。总交换容量按以下公式计算:
       Q=CHClVHCl/V。Q为树脂总交换容量(mol/L湿树脂)， CHCl为HCl的摩尔浓度，VHCl为滴定消耗的HCl体积，V为湿树脂的体积。
       2.4 静态吸附实验准确称取己处理好的用来装柱的树脂2 g，置25 ml具塞磨口锥形瓶中，加入氨基酸粗提取液10 ml，于摇床上振荡，测定上层溶液中氨基酸的含量。静态吸附量按以下公式计算:Qe= (C0-Ce)V0。Qe为静态吸附量(mg) ;C0为氨基酸初始浓度(mg/ml );Ce为氨基酸平衡浓度 (mg/ml) ;V0为吸附液体积(ml)。
       2.5 动态实验将717阴离子交换树脂置于lx25 cm的离子交换柱，取4BV体积的提取液以一定流速上柱，用二次蒸馏水洗涤至洗脱液对茚三酮呈阳性，吸附6 h后，再用二次蒸馏水洗涤至洗脱液对茚三酮呈阳性，用洗脱剂进行洗脱，至洗脱液对茚三酮呈阴性。测定不同洗脱剂洗脱得到的氨基酸的含量。
       动态吸附量按以下公式计算:Q"e= (C"0-C"e)V0。Q"e为动态吸附量(mg);C"0为上柱液中氨基酸初始浓度(mg/ml ); C"e为过柱液中氨基酸平衡浓度 (mg/ml );V"0为过柱液体积(ml )。洗脱率: De=CdVd/ Q"e ×100%。De为洗脱率(%); Cd为洗脱液浓度 (mg /ml ) ; Vd为洗脱液体积 (ml ) 。洗脱液浓缩并真空干燥，得到氨基酸样品，精确称取一定量样品，计算总氨基酸纯度:P=m1/m2×100%。P为总氨基酸纯度(%); m1为测得的氨基酸的含量(g)，m2为称取干燥样品的质量(g)。
       3 结果
       3.1 氨基酸标准曲线的绘制以3次测定的吸光值的平均值A作为纵坐标，以谷氨酸的含量作为横坐标，做谷氨酸的标准曲线,进行线性回归，得回归方程Y=0.005 3X-0.160 9，相关系数R2=0.999 7。
       3.2 不同提取方法提取含量的比较结果见表1。表1 不同提取方法含量的比较
       从表1可见，表中水提法的提取率要明显高于醇提法，超声提取法越来越多应用到中草药提取领域，可增大物质分子的运动频率和速度，增加溶剂穿透率，省时省力，超声辅助提取能大幅度的提高提取率。
       3.3 离子交换树脂总交换容量的测定取处理好的树脂装柱，用5%的NaCI溶液通过树脂柱，至流出液为中性，用去离子水洗涤，合并流出液，以HCl溶液至滴定终点。结果共消耗HCl 16.40 ml。因而717阴离子交换树脂的总交换容量为0.41 mol/L湿树脂。对于氨基酸来讲，总交换容量为56.58 g氨基酸/L湿树脂。
       3.4 717阴离子交换树脂对氨基酸提取液的吸附时间曲线结果如图1所示。由图1可以看出，随着时间的延长，氨基酸的吸附量也逐渐增大，当吸附时间达到6 h后，氨基酸的吸附量达到最大，再随着时间延长也不再增大，所以选择树脂吸附氨基酸的时间为6 h。
       图1 阴离子树脂吸附时间曲线
       3.5 pH值对7l7阴离子交换树脂吸附的影响将氨基酸粗提取液调成不同 pH值过柱，考察其对吸附量的影响。结果如图2所示。氨基酸属于两性分子在不同的pH值下呈现不同的离子状态。对阴离子交换树脂来说，应在碱性条件下上样，由图2可以看出，随着溶液pH值的升高，树脂吸附容量增大，当溶液pH值达到12时，树脂的吸附量无明显变化，所以选择最适上样pH值为12。
       3.6 洗脱剂的选择结果见表2。由表2可以看出，不同洗脱剂洗脱得到氨基酸量不同，氯化铵洗脱得到氨基酸的含量要明显高于其它3种洗脱剂。所以选择氯化铵作为洗脱剂。表2 不同洗脱剂洗脱得到氨基酸的含量
       3.7 不同浓度洗脱剂洗脱 结果如表3所示。
       图2 不同pH条件下氨基酸的吸附量表3 洗脱剂浓度考察
       实验结果表明,随着氯化铵浓度的梯度增加，洗脱量增加，0.8%浓度的氯化铵的洗脱量要比0.4%氯化铵的洗脱量高14.6%，比0.2%氯化铵的洗脱量要高22.6%，比0.1%氯化铵洗脱量高85.98%，效果明显变好，而采用不同浓度的氯化铵梯度洗脱，洗脱量要高于以上各个浓度，比0.8%氯化铵的洗脱量要高5.7%，所以选择梯度浓度的氯化铵进行梯度洗脱。
       3.8 氨基酸洗脱曲线的绘制在提取液pH=12时一定流速上717阴离子交换树脂，吸附6 h后，用0.1%，0.2%，0.4%，0.8%浓度的氯化铵，在适宜的流速下，梯度洗脱，每1 BV收集洗脱液，测定各个管中氨基酸的含量，从而绘制氨基酸的洗脱曲线。结果如图3所示。由图3可以看出随着洗脱剂体积和浓度的增大，氨基酸的洗脱量也逐渐增大，当洗脱体积达到6 BV时，洗脱达到终点，氨基酸的洗脱收率达到了87.11%。
       图3 氨基酸的洗脱曲线
       综上所述，将717阳离子交换树脂置于lx25 cm的离子交换柱，取4 BV氨基酸的水提液在pH=12时上柱，吸附6h后，用0.1%，0.2%，0.4%，0.8%浓度的氯化铵，在适宜的流速下，梯度洗脱，当洗脱体积达到6 BV时，洗脱液对茚三酮呈阴性,洗脱达到终点，氨基酸的洗脱收率可以达到87.11%,氨基酸的纯度可达到92.12%。可见此工艺条件达到了理想的实验效果,由此确定了最佳的工艺条件。
       4 总结与讨论
       植物体中的氨基酸不仅是蛋白质的组成成分 ,还是许多植物药材的有效成分或特征物质。如，具有明显的截疟、止痢、疏风、活血功能的新疆阿魏的氨基酸总量为0.20%[15]，有行气，消食，化痰镇咳，生津，止渴之功效的黄皮果中游离氨基酸总量为 0.48%[16]，有消炎、止痛、利胆消食之功效的海南山苦茶植物叶中总游离氨基酸含量为 0. 2 % ，高山冰缘植物游离氨基酸含量为0.013%～0.28%[17]，可用于治疗蛇咬伤、风湿筋骨痛及气管炎等症的八角连的氨基酸含量为0.15%左右[18]。具有清热化痰，开窍定惊作用的竹沥的游离氨基酸通过两种不同工艺制备含量为0.004%和0.05%[19]。本实验中超声辅助水提法得到的滇桂艾纳香中氨基酸的提取率可达到0.220%，因此，滇桂艾纳香在提取氨基酸上应该具有较大潜力。
       几乎所有的氨基酸分离纯化工艺均利用了氨基酸在不同的 pH 值时荷电不同这一特性。氨基酸的分离纯化方法有: 沉淀法、离子交换法、萃取法和膜分离法等几种[20]。不同型号的活性炭在氨基酸吸附脱色工艺中也应用广泛[21，22]。
       一直以来，离子交换法被广泛应用于物质的分离，主要对象为带有电荷、离子形式的物质。目前，离子交换树脂应用于氨基酸、抗生素、生物碱、肽类、蛋白质、有机酸、核苷酸等的提取分离[23]。离子交换法分离氨基酸本实验中717阴离子交换树脂纯化滇桂艾纳香氨基酸的最优条件为：吸附液pH为12，洗脱剂为NH4Cl，洗脱条件为0.1%，0.2%，0.4%，0.8%梯度洗脱，洗脱剂用量与树脂体积比为6∶1，收集梯度洗脱的洗脱液，浓缩并真空干燥，纯化后可将粗提物氨基酸的含量提高到92.12%，达到了理想的实验效果。的纯度较高，相对于其他传统的分离方法，有明显的优势[24]。阴离子交换树脂吸附茶氨酸、谷氨酸、赖氨酸等均收到良好效果 [25～27]。
       本实验中717阴离子交换树脂纯化滇桂艾纳香氨基酸的最优条件为：吸附液pH为12，洗脱剂为NH4Cl，洗脱条件为0.1%，0.2%，0.4%，0.8%梯度洗脱，洗脱剂用量与树脂体积比为6∶1，收集梯度洗脱的洗脱液，浓缩并真空干燥，纯化后可将粗提物氨基酸的含量提高到92.12%，达到了理想的实验效果。
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