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       【摘要】 
       目的研究外界培养条件的变化对红花离体培养过程中不同发育阶段培养物的影响。方法以红花种子诱导的无菌苗子叶为外植体，分别接种至含有不同碳氮源、不同PH值、不同温度、不同湿度和不同光照的培养基中，观察其生长情况。结果通过实验筛选出蔗糖浓度为3%，KNO3浓度为MS培养基中KNO3浓度的2倍，最佳pH为6.2，红花离体培养体系在24℃，30%的相对湿度，16 h光照，8 h黑暗交替培养的条件下，最利于红花的分化。结论3%的蔗糖作为碳源，最适合愈伤组织的生长;2倍于MS培养基中的KNO3含量有利于愈伤组织的生长和不定芽的分化;pH值为6.2时，最适宜红花不同阶段培养物的生长;24℃为红花离体培养的最适温度，生根时的温度为21℃较好;湿度为50%时，适于愈伤组织鲜重积累，30%的湿度适于不定芽分化和生根;黑暗培养利于鲜重积累，16 h光照，8 h黑暗交替培养有利于不定芽的分化，8 h光照，16 h黑暗交替培养有利于生根。
       【关键词】  红花愈伤组织; 不定芽; 蔗糖 ; 氮源; pH值; 温度; 湿度; 光照
       Effect of Changed Cultivation Condition on Safflower Culture in vitro
       YING Jing, LI Tianhang, XIONG Lidong, FU Hongqi, LI Xiaokun*
       (R & D Center for Biological Reactor and Drug, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of changed outside culture conditions on the safflower at the different development stages of culture in vitro. MethodsThe safflower cotyledon induced by safflower seeds as explants were inoculated into medium with different carbon , nitrogen sources, PH, temperatures, humidity and light and its growth situation was observed. Results3%sucrose concentration, 2 times MS medium KNO3 concentration the optimal pH of 6.2 were selected, safflower in vitro culture system at 24 ℃, 30% relative humidity, 16 h light, 8 h dark cycle under the conditions of culture, the most beneficial to the flower differentiation were selected .Conclusion3% sucrose as a carbon source, the most suitable for callus growth; 2 times KNO3 content in MS medium in favor of the callus growth and differentiation of adventitious buds; pH value of 6.2, the best safflower cultures at different stages of growth; 24 ℃ for in vitro culture of safflower optimum temperature, take root when the temperature of 21 ℃ for the better; humidity of 50%, suitable for callus accumulation of fresh weight, 30% humidity suitable for differentiation of adventitious buds and root; dark culture conducive to the accumulation of fresh weight, 16 h light, 8 h dark turn of the culture is conducive to the differentiation of adventitious buds, 8h light, 16h dark turn of the training will help take root.
       Key words： Safflower calli; Adventive bud; Sucrose; Nitrogen source pH; Temperature; Humidity; Illumination
       红花为菊科一年或二年生双子叶草本植物，喜温暖、干燥气候，抗寒性强，耐盐碱。红花全身是宝，花、籽粒、茎叶、秸秆等均可综合利用，是一种集药材、油料、染料为一体的特种经济作物[1]。由于红花无性快繁体系很难建立，并且目前国内对红花离体培养的研究很少，因此本文通过改变不同的培养条件来研究红花无性快繁体系的建立，以期有利于红花的资源保护、扩大繁殖和进一步推广应用。
       1 材料与方法
       1.1 材料红花种子由新疆塔城种子公司提供; 实验以采收后1年后的红花种子不同日龄无菌苗子叶作为外植体。
       1.2 方法红花种子，经70%酒精清洗30 s， 0.1 %升汞表面灭菌10 min, 无菌水洗4～5次，接种到种子萌发培养基: 1/2MS+1.5%蔗糖+1 mg·L-1GA中，取接种7日龄的红花无菌苗子叶作为外植体, 分别接种至含有不同碳氮源、不同pH值、不同温度、不同湿度和不同光照的愈伤组织诱导培养基和中;培养一段时间后，测定愈伤组织的鲜重增长量。
       子叶完全愈伤化以后，将其转入不同pH值的分化培养基中，诱导不定芽的产生。设置不同的温度梯度和不同光照强度的条件，培养25 d后，观察不定芽的形成情况，观察分化情况，待不定芽形成以后，将其移至生根培养基中，每20 d继代1次，观察生根情况。
       2 结果
       2.1 碳源在红花愈伤组织生长过程中的作用碳源既是重要的能源物质，也是一种重要的渗透压调节物质，对植物离体形态发生起着非常重要的作用。而碳源的主要提供形式是糖类物质，其中以蔗糖最为普遍，蔗糖是植物体内糖类运输的主要形式，也是某些植物贮藏的主要化合物。有研究认为，蔗糖的浓度对于组织培养很重要，适当的浓度对于维持培养基渗透势，提高植物组培再生频率具有重要意义。因此，本实验探讨了不同的蔗糖浓度在红花脱分化过程中起的作用，分别取1%～7%的蔗糖添加到培养基中，结果见图1，以红花愈伤组织鲜重增长量计算，培养基中加入的蔗糖含量在1%～3%范围内，鲜重增长量呈上升状态，蔗糖含量在3%～7%范围内，红花愈伤组织的鲜重增长量呈下降趋势，蔗糖含量在3%时，愈伤组织鲜重增长量出现峰值，达到6.8 g，蔗糖含量低于3%时，在培养初期，鲜重增长迅速，培养后期，鲜重增长缓慢，以致收获时，生物积累量不高，蔗糖含量高于3%时，鲜重增长量明显下降，说明蔗糖含量过高，不利于细胞生物量的积累。
       图1 碳源对红花愈伤组织生长的影响
       2.2 氮源对红花愈伤组织生长的影响培养基成分影响植物离体形态发生的效果，在植物组织培养过程中，KNO3和NH4NO3是两个重要的氮素来源，其含量高低可影响愈伤组织生长、离体形态发生，且不同植物、不同的离体培养时期对KNO3和NH4NO3的需求亦不同。在红花愈伤组织培养基中添加了不同浓度的KNO3和NH4NO3，观察二者对红花愈伤组织、不定芽和生根情况的影响。由表1可知，NO-3和NH4+均有利于细胞生长，当MS培养基中去除NH4NO3，仅加入KNO3时，细胞生长缓慢，不定芽分化率极低，但分化出的不定芽伸长略有伸长;当MS培养基中仅加入NH4NO3，去除KNO3时，细胞生长极其缓慢，对不定芽的分化及生根没有促进作用;在MS培养基中加入2倍KNO3时，细胞生长快速，比正常高出4.6%，不定芽分化效果较好，对不定芽伸长起到明显的促进作用，生根情况与正常接近;在MS培养基中加入2倍NH4NO3时，细胞生长一般，比正常低出6.2%，不定芽分化效果与正常MS接近，对不定芽伸长起抑制作用，生根情况与正常MS接近。因此说明，①细胞生长量的积累和不定芽的分化、伸长所需的氮源均不是单一形式的，既需要硝态氮又需要氨态氮，只有二者配合使用才能达到理想效果;② KNO3的含量加倍有利于细胞生长量的积累，同时还利于红花不定芽的分化，对不定芽的伸长起到明显的促进作用;③NH4NO3的含量加倍，对不定芽的伸长起到抑制作用。表1 氮源对红花愈伤组织生长的影响“-”表示无 ; “+”表示生长缓慢 ; “+”越多表示效果越好
       2.3 红花培养物在不同酸碱性培养基中的生长情况基质初始pH 值是植物组织和细胞培养的主要影响因子，它直接影响培养物的生长、分化和物质积累。基质最适初始pH值一般为5.0～6.0，但因植物培养的不同种类、不同部位及不同生理状态而异。本实验将培养基的pH值设置5个梯度，分别为5.4，5.8，6.0，6.5，7.0观察其对红花培养物的影响。结果见表2，pH值的变化对愈伤组织的鲜重、不定芽的分化和生根均有一定影响。在一定范围内，鲜重增长量随pH值的上升而上升，pH值为6.2时，达到峰值，之后又随之下降。当培养基偏酸性即pH值为5.4时，不定芽的分化率低，叶片为浅绿色、水分含量高;pH值为6.2时，不定芽分化数量相对较多，且叶片颜色深绿，水分含量少，抗逆性强;当培养基为中性即pH值为7.0时，不定芽分化极少，可能是由于中性环境的培养基过硬，不利于生长调节物质在胞内的运输，以致愈伤组织难以吸收养分，难以分化形成不定芽。
       2.4 温度对红花培养物的影响红花分为春播和复播，春播红花适宜期在4月上旬; 春播红花在5月份处于出苗、分枝期,温度较适宜。复播在6月左右，复播红花7、8月处于苗期和花期生长阶段, 出苗期间气温偏高，出苗速度加快，花期是红花开花授精、籽粒开始形成的关键时期，故生长期间需要有较好的光热及水肥条件,要求日平均气温保持在25～27℃。本实验将培养物分别置于18℃，21℃，24℃，27℃，30℃下培养，比较不同温度对培养物的培养效果，结果见表3，24℃是愈伤组织培养的最佳温度，24～27℃形成的不定芽状态都较好，但21℃生根效果较好。这证明了较高的气温利于出苗。表2 pH值对红花生长的影响“-”表示无 ; “+”表示生长缓慢 ; “+”越多表示效果越好
       2.5 湿度对红花培养物的影响红花有强大的直根(根深达213 cm),能吸收土壤深层的水分，同时，枝叶均具有很厚的蜡质层,能降低因蒸腾作用而消耗的水分，所以耐旱怕涝是红花的重要习性之一。新疆气候极为干旱，年降水量北疆为100～250 mm;南疆在100 mm以下，在稍有灌溉条件的土地上种植红花，则生长良好。根据红花的这一习性，设计了不同湿度条件来考察离体培养条件下红花的生长情况。结果发现，随着湿度的不断升高，鲜重增长加快，湿度达到70 %时，愈伤组织含水量和鲜重增长量均达到最高，但愈伤组织出现玻璃化现象，且不利于分化形成不定芽，湿度为30 %时，不定芽分化及生长状态均较好，生根情况也良好，湿度达到90 %时，鲜重增长反而下降，愈伤组织呈透明状，继续培养将会死亡。
       2.6 光照在红花培养过程中所起的作用光照对外植体愈伤组织的发生和不定芽的分化有很大的影响，它的作用不能为任何种类的植物生长调节物质所代替。离体培养条件下培养物需要光照，且培养物的不同发育阶段对光照的需求亦不相同。结果见表5。黑暗培养有利于愈伤组织细胞生物量的积累，同时利于生根，但不利于分化不定芽;短时间光照与长时间黑暗交替培养，不利于愈伤组织分化形成不定芽;长时间光照与短时间黑暗交替培养，也出现较多绿色芽点，有利于分化形成不定芽，也有根生成;而光照培养愈伤组织为坚硬状态，且有绿色芽点出现，但芽点分化数目不是很多，不利于生根，这于红花喜光照的特性相符。因此不同的发育阶段就应选择不同的光照条件。表3 温度对红花生长的影响表4 湿度对红花生长的影响“-”表示无 ; “+”表示生长缓慢 ; “+”越多表示效果越好3 讨论
       在植物组织培养过程中，外界环境的改变均可影响植物的生长状况。高文远等[2，3]的两次卫星搭载实验均表明,空间环境对红花的生长发育、酶活性等有一定影响,从而间接影响红花的产量和质量。黄永发等[4]进一步研究发现,空间因素对红花中的芦丁、槲皮素、山萘酚3种黄酮类成分的含量有一定影响。表5 光照对红花生长的影响
       情况黑暗7.0淡黄色近似透明状愈伤组织没有不定芽分化++光照5.2绿色，坚硬的愈伤组织，且有绿色芽点形成不定芽分化数量不多，叶片为深绿色-8h光照，16h黑暗交替6.6浅黄色松散愈伤组织不定芽分化数量不多，叶片为浅绿色，部分叶片含水量高++16h光照，8黑暗交替6.0.绿色，大部分较为坚硬的愈伤组织，且有绿色芽点形成不定芽分化数量较多，叶片为深绿色+
       “-”表示无 ; “+”表示生长缓慢 ; “+”越多表示效果越好
       在植物组织培养的过程中，不论是化学因素还是物理因素都起着不容忽视的作用。植物的茎、叶都可以产生蔗糖，光合作用在叶绿体基质中形成的磷酸丙糖，经叶绿体被膜上的磷酸转运器与无机磷交换进入细胞质，在相关酶的催化下形成蔗糖。正因为细胞壁中有蔗糖酶，植物组织培养基中的蔗糖分子扩散进入细胞壁后，能够被蔗糖酶水解为葡萄糖和果糖，这些单糖分子再以主动运输方式进入外植体细胞被利用。氮源含量的高低也可影响愈伤组织生长、离体形态发生，pH值也是红花离体培养过程中诸多影响因子中的一个，它可能影响膜状况、跨膜流、生长调节物质在胞内的作用、呼吸状况、细胞的分裂和分化。关于红花组织培养发育过程的机制还有待于进一步研究。
       【参考文献】
         　　[1] 鲍海荣.红花栽培技术中国林副特产[J].2004，72(5):14.
       
       [2] 高文远，赵淑平，薛 岚，等. 空间环境对红花萌发和营养生长的影响[J] . 中国中药杂志，1998 , 23 (12) : 712 .
       
       [3] 高文远，赵淑平，薛 岚，等. 红花卫星搭载实验的进一步研究[J ] .中国中药杂志，1999 , 24 (4) : 203 .
       
       [4] 黄永发，孙亚洲，楼 舸，等. 高效液相色谱法研究空间环境对红花中黄酮类成分含量的影响[J] . 首都医药，2003 ，10(10) : 49 .