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       【摘要】 
       目的探讨毛菊苣种子药材的鉴别方法,完善毛菊苣种子的药材质量标准。方法采用薄层色谱法,对毛菊苣种子中活性成分秦皮乙素进行鉴别;以高效液相色谱法测定秦皮乙素含量。选用Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),流动相为甲醇-0.3%甲酸(25∶75), 流速1.0 ml·min-1,检测波长349 nm,进样量10 μl。结果薄层色谱中秦皮乙素斑点清晰,无干扰。高效液相色谱法精密度、重复性良好;秦皮乙素在0～0.2 μg范围内有较好的线性关系，3批药材中秦皮乙素含量分别为0.099 7，0.110 9，0.097 2 mg·g-1。结论该方法稳定、可靠,为评价毛菊苣种子药材的质量提供科学依据。
       【关键词】  毛菊苣种子; 质量标准; 秦皮乙素
       Study on the Quality Specification of the Fructus cichorium
       WU Tao, ZHONG Jie, XIN Xuelei, Haji Akber Aisa*
       (Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Aridzone, Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, P.R.China)
       Abstract:ObjectiveTo improve the quality standard for Fructus cichorium by studying the method of discriminating the seeds.Methods Fructus cichorium was identified by TLC. The content of esculetin in fructus cichorium was determined by HPLC. The Phenomenex Luna C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used, mobile phase was methanol-0.3% methanoic acid solution (25∶75), the flow rate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 349 nm.ResultsThe TLC spots developed were fairly and simply identical. HPLC was accurate and reproducible. Esculetin showed a good line relationship within the range of 0～0.2 μg.The content of esculetin in samples was 0.099 7 mg·g-1, 0.110 9 mg·g-1 ,0.0972 mg·g-1, respectively.ConclusionThis method is stable and reliable, and can provide scientific basis for evaluation of the quality of the Fructus cichorium.
       Key words:Fructus cichorium; Quality specification; Esculetin
       毛菊苣种子是菊科植物毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss.et Huet或菊苣Cichorium intybus L.的干燥成熟种子，为维吾尔医最常用的药物之一。首载于《拜地医药书》，维语名叫卡申·欧如合，主治湿热性或血液质性疾病，如肝脏阻塞、湿热性肝炎、肾炎，小便不利以及全身性水肿等[1]。在《维药标准》中收载的许多成方中，毛菊苣种子被频繁地使用，但在《中国药典》及《维药标准》中均未收载，关于毛菊苣种子的研究国内很少有文献报道，目前毛菊苣种子只在理化性质和生药学上有相关研究[2]，含量测定未见报道。
       毛菊苣种子中含有香豆素类成分秦皮乙素，具有保肝活性，在药材中含量较高[3，4]，专属性强，可以作为菊苣药材定量指标。本实验通过薄层色谱法、高效液相色谱法对毛菊苣种子中活性成分秦皮乙素进行鉴别，并进行含量测定，以期为制定毛菊苣种子的质控标准、开发新药奠定基础。
       1 材料与仪器
       高效液相色谱仪器：戴安(Dionex，USA)，P680 HPLC泵，ASI-100自动进样器，UVD170U紫外检测器，Chromeleon色谱工作站。试剂均为分析纯，HPLC流动相试剂为色谱纯。
       毛菊苣种子采购于新疆和田地区，由中国科学院新疆生态地理研究所张立运研究员鉴定为鉴定为菊科植物毛菊苣Cichorium glandulosum Boiss.et Huet的干燥成熟种子, 批号分别为070026，071105和071139。秦皮乙素对照品购自中国药品生物制品检定所(批号110741-200506)。
       2 方法与结果
       2.1 药材性状本品为小瘦果，略呈方柱状长倒卵形，长2～4 mm，中部直径0.8～1.2 mm。表面灰白、灰棕至棕褐色;具多条纵棱，较明显的4～6条;在放大镜下可见密被短茸毛;顶端平截，具一稍隆起的明显圆环，为冠毛鳞片状，灰白色至浅棕色，长约0.5 mm(放大镜下可见刺毛状分枝);果实顶端中央处有一小的圆形突起的种脐;基部较狭，亦平截。切断面皮部浅棕色，内部白色。无气，味略苦。
       2.2 浸出物、总灰分、酸不溶性灰分和水分的测定
       2.2.1 测定方法浸出物测定参照《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录XA浸出物测定法，采用热浸法测醇溶性浸出物;总灰分、酸不溶性灰分测定参照《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录Ⅸ K灰分测定法;水分测定是参照《中国药典》2005年版(Ⅰ部)附录Ⅸ H水分测定法(烘干法)。
       2.2.2 测定结果3批样品的浸出物、总灰分、酸不溶性灰分和水分的测定结果见表 1～4。表1 药材浸出物含量测定表2 药材总灰分含量测定表3 毛菊苣种子药材酸不溶性灰分含量测定表4 毛菊苣种子药材水分含量测定
       由表1～4知，3批供试品药材浸出物测定结果最高值为12.5%，最低值为9.33%，平均值为10.62%，为控制药材质量，浸出物暂定不得少于8.0%;总灰分结果最高值为11.6%，最低值为8.97%，平均为10.41%，故暂定总灰分不得过13.0%;酸不溶灰分最高值为3.3%，最低值为2.03%，平均为2.63%，故暂定酸不溶灰分不得过4.0%;水分测定结果最高值为6.33%，最小值为4.67%，水分平均为5.48%，暂定为不得过8.0%。
       2.3 薄层色谱鉴别
       2.3.1 对照品溶液制备取秦皮乙素对照品0.3 mg，加甲醇制成0.3 mg·ml-1对照品溶液。
       2.3.2 供试品溶液制备取毛菊苣种子粉末1 g，加甲醇50 ml，超声波提取30 min，放冷，过滤，滤液浓缩后，残渣加甲醇2 ml溶解，作为供试品溶液。
       2.3.3 薄层色谱条件及结果按照“2005年版”《中国药典》薄层色谱法(附录ⅥB)试验，分别吸取供试品溶液，秦皮乙素对照品溶液各20 μl，分别点于硅胶G板，以甲苯∶醋酸乙酯∶甲酸∶乙醇(4∶4∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，热风吹干，放置后置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点。见图1。
       1.秦皮乙素 2.毛菊苣种子(批号070026)
       3.毛菊苣种子(批号071105) 4.毛菊苣种子(批号071139)
       图1 毛菊苣种子薄层色谱图(365 nm)
       2.4 含量测定
       2.4.1 色谱条件色谱柱Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，体积流量：1.0 ml·min-1,柱温30 ℃，流动相：甲醇-0.3%甲酸(25∶75),检测波长349 nm，进样量10 μl。色谱分离结果见图2。
       2.4.2 供试品制备方法考察本实验对制备供试品溶液的提取溶剂、提取方法、提取时间做考察，以秦皮乙素峰面积为考察指标，选出最佳方法。
       提取溶剂考察：取毛菊苣种子药材粉末1 g，共2份，分别精密称定，置于锥形瓶中，加以下溶剂50 ml，称定重量，至超声波提取器中提取30 min，放冷，用上述溶剂补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。依法测定。结果表明甲醇提取效果优于乙醇提取,结果见表5。
       提取方法考察：取毛菊苣种子粉末1 g，共2份，精密称定，至于锥形瓶中，加甲醇50 ml，称定重量，1份至超声波提取器中提取30 min，1份热回流提取1 h，放冷，用上述溶剂补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。依法测定。结果表明超声提取法秦皮乙素提取率稍高于热回流提取，且超声提取方便快捷，故选择超声提取方法。结果见表6。
       提取时间考察：取毛菊苣种子粉末1 g，共5份，分别精密称定，置于锥形瓶中，加甲醇溶剂50 ml，称定重量，至超声波中分别提取15，30，45，60，75 min，放冷，用上述溶剂补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。依法测定。结果表明提取30 min秦皮乙素峰面积最大。结果见表7。表5 提取溶剂考察结果表6 提取方法考察结果表7 提取时间考察结果
       2.4.3 供试品溶液制备取毛菊苣种子药材粉末1 g置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 ml，超声提取30 min，过滤，取续滤液，浓缩至10 ml容量瓶中，甲醇定容。用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品液。
       2.4.4 标准曲线的制备精密称取秦皮乙素对照品2 mg至于100 ml容量瓶中加甲醇溶解，室温稀释至刻度，摇匀，得0.02 mg·ml-1的秦皮乙素对照品贮备液。分别按不同进样体积注入液相色谱仪。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得出回归方程。Y=52.165X-0.015 5 (r=0.999 7)，线性范围0～0.2 μg。
       2.4.5 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样6次，以上述色谱条件分析测定，秦皮乙素峰面积的RSD为0.41%。
       2.4.6 稳定性实验精密吸取对照品溶液10 μl，分别在0，2，4，6，8，12 h分别进样，测定峰面积，结果对照品在12 h内RSD为7.78%，在8 h内RSD为2.42%。表明对照品12 h内不稳定，须在8 h内测定。
       2.4.7 重复性实验取药材5份，按供试品操作方法平行制备，进样10 μl连续测定3次，其RSD值为0.21%。
       2.4.8 加样回收实验精密称取已测定质量分数的药材粗粉6份,每份药材0.5 g，分别精密加入0.02 mg·ml-1的秦皮乙素对照品1 ml，按照方法处理，进样测定。结果见表8。表8 回收率实验结果
       2.4.9 含量测定取3批毛菊苣种子药材粉末各1 g，按照上述供试品溶液制备，进样10 μl，测定其秦皮乙素含量。结果见表9。表9 毛菊苣种子秦皮乙素含量测定结果
       3 讨论
       通过对毛菊苣种子前期化学成分研究，结合其在维吾尔医药中的保肝、护肝作用，本实验选取了毛菊苣种子中具有保肝、护肝活性的秦皮乙素为指标性成分对毛菊苣种子展开质量标准研究。通过薄层色谱鉴定，秦皮乙素在毛菊苣种子中可以快速地被检测出来，斑点清晰，无干扰。在含量测定方面，为了能准确地反映秦皮乙素含量，本实验对样品制备溶液的方法进行了考察，确定了最佳的样品制备方法。同时也考察了不同比例的流动相系统，曾试用甲醇-水(30∶70)，乙腈-水(10∶88)，以及乙腈-0.5%磷酸(12∶88)，分离结果都不理想，最后确定了甲醇-0.3%甲酸(25∶75)为流动相，获得了满意效果。
       本实验研究制订的薄层鉴别法和高效液相色谱测定毛菊苣种子含量的方法，简便易行，重复性好，提高了毛菊苣种子在维吾尔药中使用的安全性，也为其质量标准的制订和提高提供了依据。
       【参考文献】
         　[1] 刘伟新. 毛菊苣种子的生药学研究[J].新疆中医药杂志,2008,26(1):47.
       
       [2] 闫 明,黄 毅,刁娟娟,等. 毛菊苣种子的理化鉴别研究[J].时珍国医国药,2006,17(12):2447.
       
       [3] H.K.Wu, Z.Su,H.A.Aisa, A.Yili, et al. Components of Cichorium glandulosum seeds[J].Chemistry of Natural Compounds，2007，43(4)：472.
       
       [4] H.K.Wu, Z.Su, A.Yili, Z.P.Xiao, et al. Isolation of esculetin from Cichorium glandulosum by high-speed counter-current chromatography[J].Chemistry of Natural Compounds，2007，43(1)：109.