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       【摘要】 
       目的为充分利用大戟科珍珠草资源，优选珍珠草有效成分总多酚的提取工艺。方法以总多酚含量考察为指标，使用超声波进行提取，采用均匀设计法对工艺条件进行优化，普鲁士蓝法进行总多酚含量测定。结果总多酚最佳提取工艺：乙醇浓度10%，提取时间90 min，液料比为10，超声功率200 W。结论该方法简单可行，可作为珍珠草总多酚的提取工艺。
       【关键词】  珍珠草; 总多酚; 超声波提取; 均匀设计
       Optimization of Extraction Technique of Total Polyphenols in Pearl Grass by Equality Design and Ultrasonic Wave
       LIU Kun1，YANG Zaiyong2
       (1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 533004, China; 2. Depart. of Chemistry and Life Sciences, Baise University, Baise, 533000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study an extraction technology for total polyphenols from Pearl grass of Euphorbiaceae. MethodsThe total polyphenol was extracted with ultrasonic wave, the extraction conditions were optimized by equality design and the content was determined by Prussian blue method.ResultsThe optimum process of the extraction technology was ethano1 10%, time 90 minutes, the ratio of material to liquid 10 and ultrasonic power 200W.ConclusionThe method is simple and feasible, and can be used as the extraction process of total polyphenol from Pearl grass.
       Key words：Pearl grass; Total polyphenols; Ultrasonic extraction; Equality design
       珍珠草，又名叶下珠，大戟科草本植物，全草入药，具有清热、解毒、明目等功效。民间常用于治疗黄疸、肝炎、痢疾等疾病，现代药理实验证明珍珠草具有极强的抗乙肝病毒和保肝作用[1，2]。亚洲循症医学研究中心研究通过体外试验研究证明珍珠草是最为优秀的抗病毒中药之一[3]。2002-06由国内四十多位肝病专家参与编写的《病毒性肝炎》，评价珍珠草是“目前抗乙肝病毒研究最多，最有希望的药用植物”[4]。2002-08广西医科大学完成“抗乙肝表面抗原中草药的筛选”工作，对200种中药进行体外、体内研究证实，只有珍珠草和五倍子对乙肝表面抗原有效[5]。珍珠草中所含的没食子酸(gallic acid)、短叶苏木酚酸(brevifolincarboxylic acid)和鞣云实精(corilagin)等多酚类化合物是其主要有效成分。对珍珠草有效成分多酚的提取工艺文献鲜见报道，故有必要对之进行研究。本实验采用乙醇作为溶剂、超声波提取，利用均匀设计的试验方法对珍珠草中的总多酚进行提取，并优选出最佳提取工艺。
       1 仪器与材料
       1.1 仪器KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-2800A型紫外可见分光光度计(Unico尤尼柯(上海)仪器有限公司);T-500型电子天平(美国双杰(基团)有限公司，常熟双杰测试仪器厂);旋转蒸发器RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)。
       1.2 材料没食子酸标准品(天津市大茂化学试剂厂);珍珠草，购自广西药材站;实验所用试剂均为分析纯。
       2 方法与结果
       2.1 方法采用普鲁士蓝方法[6]测定了叶下珠中总多酚的含量。其反应原理为酚羟基具有还原性，能将Fe(CN)63-还原成Fe(CN)64-，还原产物Fe(CN)64-接着与Fe3+反应生成Fe[Fe(CN)6]3(普鲁士蓝)供定量测定。
       2.1.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品25 mg置于50 ml容量瓶中,30%甲醇水溶解并加至刻度, 得到0.5 mg/ml的对照品溶液。精密吸取该溶液1 ml置于10 ml容量瓶中, 加入30%甲醇水至刻度, 配成50 μg/ml对照品溶液。
       2.1.2 供试品溶液的制备取珍珠草提取物0.1g, 精密称量, 加入40 ml 30%甲醇水, 置水浴中微沸浸提15 min后, 趁热抽滤, 冷却后定容至100 ml。
       2.1.3 标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置于25 ml 容量瓶中, 依次加入0.100 mol/L 三氯化铁溶液0.5 ml，0.008 mol/L铁氰化钾溶液0.5 ml和0.10 mol/L 盐酸溶液0.5 ml, 定容, 得到不同浓度的对照品溶液。同时在25 ml容量瓶中加入0.100 mol/L 三氯化铁溶液0.5 ml、0.008mol/L 铁氰化钾溶液0.5 ml和0.10mol/L 盐酸溶液0.5 ml, 定容后得到空白溶液。随行空白, 在700 nm 波长处测定吸光度。以对照品的质量浓度为纵坐标, 吸光度为横坐标, 绘制标准曲线, 得线性回归方程C=2.106 1A-0.061 2, 相关系数r=0.999 2, 结果表明没食子酸在0.4～2.0 μg/ml时,质量浓度与吸光度呈良好的线性关系。
       2.1.4 精密度实验取1份样品按上述方法制备成供试品溶液, 于0，1，2，3，4 h分别测定, 每个样品测定3次的平均吸光度值RSD为1.41%。
       2.1.5 稳定性实验取同一份供试品溶液测定吸光度，结果测定5次的平均RSD为0.55% 。
       2.1.6 重现性实验取同一批样品，精密称取5份，测定吸光度并计算多酚的质量分数，结果吸光度值RSD为2.21% (n=5)。
       2.1.7 回收率计算采用加样回收法。精密称取珍珠草提取物0.1 g, 加入0.5 mg/ml对照品溶液3 ml，按上述样品制备和测定方法测定吸光度,并计算总多酚, 结果平均加样回收率为98.7%, 吸光度值RSD为2.85% (n=5)。
       2.2 提取条件
       2.2.1 工艺流程珍珠草干品→粉碎(过40目筛)→称量→装料→加盖浸泡→超声波提取→离心过滤→减压浓缩→正丁醇萃取→浓缩干燥→提取物。
       2.2.2 实验安排采用均匀设计法考察4个因素即乙醇浓度(X1)、提取时间(X2)、液料比(X3)和提取功率(X4)对珍珠草中总多酚提取率的影响。均匀实验之前，已经进行了单因素实验，在此基础上，为获得最佳工艺条件，针对以上条件做4因素7水平的均匀实验。研究因素及其水平见表1。表1 因素与水平 [U7 (74),D=0.4760]
       2.3 总多酚含量的测定称取干燥(过40目)珍珠草5.0 g，按均匀试验表所列条件，进行超声波提取。减压抽滤，蒸干，用30%甲醇定容于25 ml容量瓶中，量取5 ml样品，依“2.1.1”项下的方法测定吸光度，并换算成提取率，提取率计算：提取率(%)=(溶出成分质量/干料质量)×100%。结果见表2。表2 实验安排与结果
       2.4 回归分析利用计算机进行多元线性回归处理,得多元线形回归方程:
       Y=5.56-1.64×10-2X1+4.00×10-3X2-5.71×10-3X3-1.67×10-2X4，R=0.999 4 F=29.93>F0.05(4,2)=19.25，所以方程有显著的线形关系。方差分析结果见表3。表3 方差分析
       从上式多元回归中标准偏差回归系数可以看出，超声提取的影响效应为溶剂的用量最大，超声时间次之，超声功率最小。因为液固比太小溶液很快达到溶解饱和不利于收率的提高，液固比过大对收率没有多大影响，但溶剂量会大大增加;超声时间不够时，只有一部分细胞壁和纤维组织破坏了，大部分多酚类物质只能慢慢地渗透出来，但是超声时间过长能量消耗太大;功率太低时无法破坏珍珠草的细胞壁和纤维组织，而功率过高时也是能耗太大不可取。所以根据回归方程和实际经验，选择最佳的超声提取条件为：乙醇浓度为10%，提取时间为90 min，液料比为10，超声功率为200 W。
       2.5 实验结果验证取乙醇浓度为10%，提取时间90 min，液料比为10，超声功率为200 W时，回归方程的预测值为5.01%，按以上优化条件进行验证实验，结果为5.07%，与回归方程的预测值很相近，说明超声波优化的工艺条件具有良好的重复性。
       3 讨论
       本实验采用普鲁士蓝法测定珍珠草中总多酚, 溶液体系均一, 工作曲线线性良好，利用均匀设计的试验方法，实验结果采用多元线形回归计算和逐步回归分析，建立了回归方法，通过回归方程分析及预测，可在预测后用实验验证从而找到真正的最优条件，使实验从设计、实验到结果分析都准确、可靠，是优化中草药提取工艺的有效方法。
       此外，实验所用超声辅助提取法操作简单、快捷，具有节省时间、无须加热、提取率高的优点，可以用来提取一些受热易破坏、分解的物质，是一种适宜的方法。
       【参考文献】
         　[1] 蔡 瑾, 梁敬珏.叶下珠化学成分及药理作用研究概况[J]. 海峡药学, 2003, 15(1): 1.
       
       [2] Min Soo Shin,Eun Hwa Kang,Young Ik Lee. Aflavonoid from medicinal plants blocks hepatitis B virus-e antigen secretion in HBV-infected hepatocytes[J]. Antiviral Research，2005, 67(8):163.
       
       [3] 刘建平, 林 辉, Heather McIntosh. 叶下珠治疗慢性乙型肝炎病毒感染的系统评价[J]. 中国循证医学, 2001, 1(2): 83.
       
       [4] 陈紫榕, 刘小朋, 鼓宗根, 等. 病毒性肝炎[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2002: 168.
       
       [5] 谢志春, 陈智平, 苏洁寒, 等. 抗乙肝表面抗原中草药的筛选(体外及树鼠向动物试验)[M]. 广西医科大学学报, 2002, 19 (4): 534.
       
       [6] 石 碧. 植物多酚[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 244.