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       【摘要】 
       目的从余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物3种提取物体外筛选抗单纯疱疹病毒1型和2型的活性成分。方法通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、空斑减数法，判断药物的毒性及其抗病毒效应。结果余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物对于单纯疱疹病毒1型的半数抑制浓度分别为25.28，66.17，100.94 μg/ml;余甘子的3种提取物对于单纯疱疹病毒2型的半数抑制浓度分别为31.70，180.3，112.1 μg/ml。结论余甘子3种提取物在体外对单纯疱疹病毒1型和2型均有一定的抑制作用。
       【关键词】  余甘子; 单纯疱疹病毒1型; 单纯疱疹病毒2型; 细胞病变效应法; 空斑减数法
       Study on the Anti-HSV Activity of Crude Extract from Phyllanthus emblica in vitro
       QU Chang1,2,3,LAI Zhicai1,2,3,PEI Ying1,2,3,ZHANG Meiying2,3,WANG Yifei2,3*,ZHANG Yingjun4,YANG Chongren4
       (1.College of Pharmacology,Jinan University,Guangzhou 510632,China;2.Biomedicine Research and Development Center of Jinan University,Guangzhou 510632,China;3.National Engineering Research Center of Genetic Medicine,Guangzhou 510632,China;4.State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China,Kunming Institute Botany,Chinese Academy of Sciences,Kunming 650204,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the active components of anti- HSV-1 and HSV-2 of crude extract from Phyllanthus emblica. MethodsThe toxic and antivirous effects were evaluated by observing toxic effect, cytopathic effect(CPE), MTT colorimetric assay for vital cell rate, plaques reduction ratio. ResultsInhibition on herpes simplex virus were observed during the experiment. The IC50 on HSV-1 of acetic ether extract, methanol extract,aqueous extract from Phyllanthus emblica were 25.28, 66.17, 100.94μg/ml; while the IC50 on HSV-2 of the extracts above were 31.70, 180.3, 112.1μg/ml.ConclusionThe three extracts from Phyllanthus emblica can inhibit both of HSV-1 and HSV-2 in vitro.
       Key words： Phyllanthus emblica; HSV-1; HSV-2; CPE; Plaques reduction ratio
       单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 属于疱疹病毒科α病毒亚科，呈球形，完整病毒由核心、衣壳、被膜(Tegument)及囊膜组成。单纯疱疹病毒1型主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官;单纯疱疹病毒2型主要感染腰部以下粘膜，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。
       对于疱疹病毒的感染，临床主要使用阿昔洛韦、更昔洛韦等药物进行治疗。但此类药物的缺点是极易产生耐药的现象，国内外许多实验室都已成功分离了阿昔洛韦的耐药株[1，2]。因此开发出新的抗病毒药物成为研究病毒药物的热点。
       我国是一个中药资源很丰富的国家，本课题的研究目的就是从已经证明有抗病毒活性的南药中筛选出具有抗病毒的活性成分，并且在前期的研究中也有了一些发现[36]。余甘子为大戟科叶下珠属植物余甘子的果实，又称庵摩勒、油柑子、滇橄榄。余甘子味甘、微涩，性凉，有清热利咽、润肺止咳的功用，其药用价值早在我国古代药膳《异物志》《唐本草》《本草拾遗》及《本草纲目》中就有论述。余甘子在临床上主要用于感冒发热、咽喉痛、咳嗽、口干、烦渴、牙痛、维生素C缺乏症。本研究探讨余甘子对两种单纯疱疹病毒的作用。
       1 材料仪器
       1.1 药物余甘子晾干果实的3种提取物均由中国科学院昆明植物研究所提供。提取方法：植物样品 (100 g)，粉碎，醋酸乙酯提取，甲醇提取，热水提取，依次得到醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物。醋酸乙酯提取物、甲醇提取物用二甲基亚砜 (DMSO)溶解至1 mg/ml，水提物用水溶解至1 mg/ml，高压灭菌待用。
       1.2 细胞株和病毒株非洲绿猴肾细胞(以下称Vero细胞)购于美国ATCC公司，由本室保存。细胞生长液为含10% 胎牛血清的DMEM，细胞维持液为含2% 新生牛血清的DMEM，常规加入青霉素100 M·ml-1，链霉素100 M·ml-1。Vero细胞用生长液连续传代3次保持对数生长期供实验用。单纯疱疹病毒 1型 (以下称HSV-1) 毒株F株 和单纯疱疹病毒2型(以下称HSV-2)毒株 HSV-2333由武汉大学医学院病毒研究所提供。HSV-1和HSV-2的宿主细胞均为Vero细胞。
       1.3 器材和试剂5%CO2细胞培养箱，德国 HERAEΜS公司产品;超净工作台，苏州净化设备公司产;进口 96 孔培养板(平底)和进口 24孔培养板(平底)，美国CORNING公司产;倒置显微镜，德国LAICA公司产;培养基为 DMEM， GIBCOBRL公司产，除菌过滤后用碳酸氢钠调pH至 7.07.2;胎牛血清、新生牛血清，杭州四季青，经 56℃ 30 min 灭活补体，除菌分装;消化液为 5 %胰蛋白酶 5 ml + 5 % EDTA 2 ml + 0. 0l mol/ L (pH 7. 2) PBS 93 ml，除菌分装，低温保存;维持液为含 2% 小牛血清的 DMEM 培养基;阳性对照药物阿昔洛韦 (ACV，无环鸟苷)购于湖北科益药业股份有限公司。
       2 方法
       2.1 病毒滴度测定使用前在Vero 细胞中连传3代，活化病毒，用维持液将制备好的毒株作10倍系列稀释，10-110-10，常规方法感染单层 Vero 细胞，每个浓度设8个复孔，同时设正常细胞对照。37℃，5 %CO2培养。每天在显微镜下观察记录细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。当细胞病变不再发展时，用 Reed-Muench[7]公式计算半数细胞感染量 (median tissue culture infective dose, TCID50 )。
       2.2 细胞毒性测定Vero细胞经胰酶消化后，制成浓度为2.0×105/ml的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μl，37℃，5 %CO2培养24h。待其长成单层，弃去培养液。用维持液将6种提取物制成系列不同浓度的药液，加入到培养板中，每孔100μl，每个浓度设 4个复孔，同时设正常细胞对照组、阳性对照组，置 37℃，5%CO2培养箱里培养 48 h，其间置倒置显微镜下观察，观察药物的最大无毒浓度。
       2.3 药物抗HSV-1病毒的药效学实验(空斑减数法)Vero细胞经胰酶消化后，制成浓度为1.0×106/ml的细胞悬液，接种于24孔板，每孔1 ml，37℃，5 %CO2培养24h。待其长成单层，弃去培养液。将不同浓度药物和病毒稀释液 (40万倍稀释) 各100μl混合后加入细胞中，设4个复孔，设阳性对照组、病毒对照组和正常细胞对照组，37℃，5%CO2培养箱孵育2 h，加入由2倍的 DMEM维持液和 1% 羧甲基纤维素以 1∶1的比例配成的完全覆盖液1 ml。继续培养72 h后，弃去覆盖液，10%甲醛固定 10 min，1% 结晶紫染色30 min，用清水漂洗、晾干，参照 Nitta[8]的方法清点空斑数，计算空斑抑制率。空斑抑制率 (% ) = (病毒对照组空斑数- 药物处理组空斑数)/(病毒对照组空斑数)×100%。以药物浓度的对数值做横坐标，以空斑抑制率做纵坐标作图，根据空斑抑制率结果作出病毒对药物的敏感性曲线，由此得出药物的半数抑制浓度 (50% inhibiting concentration, IC50 )，实验重复3次。
       2.4 药物抗HSV-2病毒的药效学实验(CPE法)Vero细胞经胰酶消化后，制成浓度为2.0×105的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，37℃，5 %CO2培养24 h。待其长成单层，弃去培养液。将不同浓度的药液和病毒悬液各50 μl混合后，加到培养板中，每个浓度设4个复孔，同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组。置 37℃， 5%CO2培养箱里培养48 h，其间置倒置显微镜下观察CPE(见图1)。待病毒对照组的细胞病变达到 75%及以上时，观察并记录各样品各浓度的细胞病变情况，实验重复3次。
       3 结果
       3.1 病毒滴度测定按 Reed-Muench法计算病毒滴度：HSV-1的 TCID50 为10-6. 5，即接种滴度为 10-6. 5的病毒每孔100 μl，可使50 %细胞明显病变;HSV-2的TCID50 为10-7.0，即接种滴度为 10-7.0的病毒每孔100μl，可使50 %细胞明显病变。这两种病毒在实验中所使用的病毒滴度均为100 TCID50。
       3.2 细胞毒性测定以正常细胞无自然蜕变、不引起细胞病变的最高药物稀释浓度为对Vero细胞的最大无毒浓度TC0，余甘子的乙酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物的TC0分别为：125，250，500 μg/ml。从以上结果可看出，余甘子的3种提取物对细胞的毒性较小。
       3.3 药物抗HSV-1病毒的药效学实验(空斑减数法)在细胞毒性实验结果的基础上，各样品从125 μg/ml的浓度进行空斑减数实验的测定。通过空斑减数实验，计算得各样品的空斑抑制率以及IC50值。结果见表1。表1 3种提取物对HSV-1的空斑抑制率和IC50值
       3.4 药物抗HSV-2病毒的药效学实验(CPE法)在细胞毒性实验结果的基础上，各样品从最大无毒浓度开始进行药效学的测定。并且按照CPE观察的结果，计算出各样品的IC50值。结果见表2。表2 3种提取物对HSV-2的抑制效果和IC50值
       CPE等级：025 %为(+);26 %50 %为(++);51 %75 %为(+++);76 %100 %为(++++);HSV-2对照组：(++++);细胞对照组：-;未做浓度：/
       A病毒对照 B正常细胞对照 C阳性对照(阿昔洛韦，3.2 μg/ml) D余甘子醋酸乙酯提取物，125 μg/ml E余甘子甲醇提取物，250 μg/ml F余甘子水提物，250μg/ml
       图1 各实验组细胞培养图
       4 讨论
       本研究分别通过空斑减数法和CPE法测定了余甘子的3种提取物抗单纯疱疹病毒1型和2型的作用。从表1和表2的结果可以表明，余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物对这两种病毒都有良好的抑制作用。其中以醋酸乙酯提取物的效果最好，对HSV-1和HSV-2的半数抑制浓度IC50分别是25.28，31.7 μg/ml。
       余甘子富含单宁、有机酸、酚类等[9]。近年来，许多对于单宁类物质的研究表明，它不仅具有良好的抗氧化、抗肿瘤的作用，对于艾滋病毒、乙肝病毒、单纯疱疹病毒等多种病毒均有良好的抑制作用[1014]。
       美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)于2006-10-30批准Veregen TM成为处方药。它是50年来第1个被批准在美国上市销售的复合成分植物药，用于具有免疫能力的18周岁以上的外生殖器和肛周疣(尖锐湿疣)患者。其所含药物组分为kunecatechins，是绿茶水提取物的部分纯化组分(实质是儿茶素和其他绿茶组分的混合物)。Veregen TM的主要有效成分属于单宁，该药品的上市给其他中药提取物走出国门带来无限希望。本研究中，余甘子提取物对疱疹病毒的抑制作用，也有可能源于其所含单宁成分的作用。笔者认为，对于余甘子醋酸乙酯提取物应当进行进一步的提取分离，确定提取物所含的成分及含量，并且进行动物实验来进一步验证。
       【参考文献】
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