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       【摘要】 
       目的研究地锦草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的影响，探讨其抗真菌作用机制。方法药物干预红色毛癣菌后分离菌体，按试剂盒要求处理样品，利用酶联免疫法和荧光分光光度法，研究地锦草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的作用。结果地锦草提取物256 μg·ml-1时，可显著降低红色毛癣菌中角鲨烯环氧化酶的活性(P<0.01);不同浓度的地锦草提取物，均可降低红色毛癣菌β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)。结论地锦草提取物抗真菌机制可能与抑制角鲨烯环氧化酶和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性有关。
       【关键词】  地锦草提取物; 角鲨烯环氧化酶; 酶联免疫吸附试验; β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶; 荧光分光光度法
       Study on the Effect of Euphorbia humifusa Extract on Enzymatic Activity of Trichophyton rubrum
       AN Huixia1, LI Zhijian1, Gulnar·Dawuti2, Silafu·Aibai2,3
       (1.Shihezi University , Shihezi 832000, China;2. Xinjiang Uighur Medical Hospital, Urumqi 830049, China;3. Institute of Xinjiang Uighur Medicine, Urumqi 830049, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of Euphorbia humifusa extract(EHE) on squalene epoxidase and β-(1,3)-D-glucan synthase of T.rubrum and its mechanism. MethodsTreated T.rubrum with EHE, studied the effects of EHE on squalence epoxidase activity in T.rubrum cell membrane by ELISA test and β-1,3-glucan synthase activity in T.rubrum cell wall by fluorospectrophotometry. ResultsThe ELISA test results showed that squalene epoxidase activity was decreased significantly(P<0.01, vs growth control) in T.rubrum when the concentration of EHE was 256 μg·ml-1. The fluorospectrophotometry test results showed that β-(1,3)-D-glucan synthase activity was decreased significantly in T.rubrum treated with low, middle and high concentrations of EHE(P<0.01, vs growth control). ConclusionThe antifungal mechanism may be related to its inhibition on squalene epoxidase and β-(1,3)-D-glucan synthase activity in fungus.
       Key words：Euphorbia humifusa extract; Squalene epoxidase; Elisa test; β-1,3-D-glucan synthase; Fluorospectrophotometry
       红色毛癣菌T.rubrum是临床常见的皮肤癣菌，也是浅部真菌病的主要病原菌，其中69.5%的皮肤癣菌病是由红色毛癣菌感染所致[1，2]。地锦草Euphorbia humifusa是维吾尔医常用药材，临床主要用于治疗手癣、体癣、足癣、花斑癣及银屑病等[3]。文献报道[48]，地锦草具有显著的抗真菌作用，尤其对毛癣菌属Trichophyton的红色毛癣菌最敏感。为了探讨地锦草提取物抗皮肤癣菌的作用机制，本实验研究了地锦草提取物对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性和β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的影响，为地锦草的开发利用提供实验依据。
       1 材料
       1.1 药物地锦草提取物(EHE，批号：20080117)，由新疆维吾尔医药研究所药剂室提供，提取方法及质量控制，参照《中华人民共和国药品标准·维吾尔药分册》中百癣夏塔热片之地锦草提取方法及质量控制[9]，用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为102.4 mg·ml-1的储存液，存于-60℃冰箱备用。
       1.2 菌株红色毛癣菌T.rubrum 1株，菌株编号：XYZ T.r 40001，由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库(XYZ)提供。
       1.3 试剂RPMI-1640培养基和三氮吗啡琳丙磺酸(MOPS)，美国Gibco公司产品;沙堡氏琼脂培养基(SDA)，北京奥博星生物科技有限公司产品，批号：20080228;真菌角鲨烯环氧化酶酶联免疫分析试剂盒(Fungus squalence epoxidase ELISA kit)，美国Uscnlife公司产品，编号：EN1007fu;GENMED真菌细胞β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性定量检测试剂盒，美国GENMED SCIENTIFICS INC产品，编号：GMS50276.1v.A。
       1.4 仪器FM型生化培养箱，上海福玛实验设备有限公司产品;BHC-1300ⅡA型生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司产品;Allegra64R型高速低温离心机，美国Beckman公司产品;JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎仪，宁波新芝科器研究所;Bio-Rad 550型酶标仪，美国伯乐公司产品;F2500荧光光度计，日本日立高新科技公司产品。
       2 方法
       2.1 实验分组及药物干预实验分生长对照组(空白生长对照菌)和EHE低、中、高浓度组(EHE的浓度由低向高依次为64，128，256 μg·ml-1)。参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》(M38-A)[10]，将不同浓度的EHE和红色毛癣菌(XYZ T.r 40001)在26 ℃孵育7 d，收集菌丝样品用于酶活性测定。
       2.2 角鲨烯环氧化酶活性测定收集培养液，1 000 g离心10 min分离得到菌丝样品，用PBS(pH 7.0)缓冲溶液漂洗3次，每次1 000 g离心10 min，弃上清。每组精密称取菌丝样品0.3 g，各3份，分别加入PBS(pH 7.0)缓冲溶液1 ml，置于冰浴上超声破碎细胞，-20℃放置过夜，次日反复冻融2次，5 000 g离心5 min，取上清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行酶活性测定。
       2.3 β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性测定收集培养液，准备5 ml待测的新鲜真菌细胞(OD600范围在0.40.8之间，即12×107细胞/ml)，移入到预冷的5 ml离心管，置于冰槽里5 min，放进4℃离心机离心10 min，速度为3 000 g，小心抽去上清液，加入250 μl GENMED裂解液，充分混匀，转移到预冷的1.5 ml离心管，加入100 μl GENMED强化液，强力涡旋振荡15 s，置于冰槽里1 min，重复5次，加入250 μl GENMED，充分混匀，放进4℃离心机离心10 min，速度为1 000 g，小心移取500 μl上清液到新的预冷的1.5 ml离心管，即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作。严格按照试剂盒说明书进行酶活性测定。
       2.4 统计学分析测定结果均以±s表示，采用PEMS 3.1数据处理软件，组间比较采用 t检验。
       3 结果
       3.1 对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响ELISA实验结果表明，各实验浓度EHE均可使红色毛癣菌(T.rubrum)角鲨烯环氧化酶的活性降低。EHE为256 μg·ml-1时，对角鲨烯环氧化酶活性的影响有显著性差异(P<0.01)。结果见表1。表1 EHE对红色毛癣菌角鲨烯环氧化酶活性的影响EHE高浓度组与生长对照组比较，**P<0.01;EHE高浓度组与低浓度组比较，△P<0.05;高浓度组与中浓度组比较，#P<0.05;n=3
       3.2 对红色毛癣菌β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的影响实验结果表明，不同浓度的地锦草提取物，均可降低红色毛癣菌β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)。结果见表2。　表2 EHE对红色毛癣菌β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的影响EHE高、中、低浓度组与生长对照组比较，**P<0.01;EHE高、中浓度组与低浓度组比较，△△P<0.01;EHE高浓度组与中浓度组比较，+P>0.05;n=3
       4 讨论
       角鲨烯环氧化酶是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路中的一个重要酶，它能使角鲨烯转变成羊毛甾醇。目前，临床常用的烯丙胺类及硫脲类药物，通过作用于角鲨烯环氧化酶，导致真菌重要膜成分麦角甾醇生物合成受抑而缺陷，发挥抑菌作用;角鲨烯的最终积聚，脂滴沉积于细胞壁及细胞浆内，导致膜破裂和细胞死亡，发挥杀菌作用[11]。ELISA实验表明，地锦草提取物256 μg·ml-1时，可显著降低红色毛癣菌中角鲨烯环氧化酶的活性(P<0.01)，因此，其抗真菌机制可能与抑制角鲨烯环氧化酶的活性，影响麦角甾醇的生物合成有关。
       真菌细胞壁的主要物质为碳水化合物，主要有甘露聚糖蛋白、几丁质和β-葡聚糖(β-1,3-glucan synthase)组成。β-葡聚糖是细胞壁的主要成分，占细胞干重的48%60%，由β-(1,3)键(67%)和β-(1,6)键(14%)连接而成，它保证细胞渗透压的稳定性，并且在细胞生长和分裂过程中起重要作用[12]。抑制了β-(1,3)-葡聚糖合成酶，就可致细胞壁结构破坏，细胞破裂死亡。荧光分光光度法研究得出结论，不同浓度的地锦草提取物，均可降低红色毛癣菌β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)。地锦草提取物在64 μg·ml-1时，就可显著降低红色毛癣菌中β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性(P<0.01)，且存在剂量依赖性。因此，地锦草提取物抗真菌机制，可能是通过抑制β-(1,3)-D-葡聚糖合成酶，导致多聚葡聚糖的合成受阻，细胞生长周期停滞，真菌细胞壁的完整性被破坏，真菌细胞内渗透压不稳定，最终导致真菌细胞溶解死亡。
       【参考文献】
         　[1] Mukherjee PK, Leidich SD, Isham N, et al. Clinical Trichophyton rubrum strain exhibiting primary resistance to terbinafine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003，47:82.
       
       [2] 李治建，斯拉甫·艾白，古丽娜·达吾提，等.高效液相色谱法分析红色毛癣菌麦角甾醇的含量[J].石河子大学学报，2009，27(1)：73.
       
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