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       【摘要】 
       目的评价丹参素对低氧低糖诱导人拟神经元细胞SH-SY5Y损伤的影响。方法采用细胞培养于人工无糖培养基、1.5% O2和5% CO2环境建立低氧低糖损伤SH-SY5Y细胞模型。以SRB方法测定存活细胞数，相差和荧光显微镜观察细胞凋亡，采用细胞培养上清乳酸脱氢酶(LDH)活性反映细胞受损伤程度，并测定了细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活性以反映细胞氧化胁迫状态。结果低氧低糖损伤24 h，存活细胞数量明显减少，SH-SY5Y细胞皱缩、吖啶橙和溴化乙啶双染可见明显核皱缩、碎裂及凋亡小体出现，细胞培养上清LDH水平明显升高，细胞内MDA含量明显升高，SOD水平降低，表明细胞受到严重的氧化胁迫损伤。丹参素可抑制细胞内SOD活性的降低，对上述各损伤指标均有明显的干预作用，且具有浓度依赖性。结论丹参素对低氧低糖所致SH-SY5Y神经瘤细胞损伤有明显保护作用，有望成为有临床应用价值的神经保护剂。
       【关键词】  丹参素; 低氧低糖损伤; 神经保护; 氧化胁迫
       神经细胞凋亡在脑缺血缺氧性损伤所致神经功能丧失过程中起着至关重要的作用，一些药物可通过干预神经细胞凋亡过程阻止缺血性损伤的进一步发展，而发挥对缺血性脑病的治疗作用。在脑缺血性损伤机制中，自由基链锁反应被认为是造成脑组织损害的重要机制之一，缺血后再灌注可促发自由基的链锁反应，加剧神经元凋亡和坏死，加重脑组织缺血性损伤[1]。因此，清除自由基、切断自由基对脑缺血的继发性损害成为目前神经保护治疗的重要靶点之一，依达拉奉作为自由基清除剂的临床成功应用也证明了这一点[2]。丹参作为中药典型的活血化瘀药，被广泛用于治疗缺血性心脑血管疾病。丹参素(danshensu)是丹参的有效活性成分，具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制细胞内Ca2+升高等作用[3]。张文生等[4～6]采用连二亚硫酸钠阻断呼吸链模拟低氧环境，证明丹参素对神经细胞低氧低糖损伤具有保护作用，但化学性低氧难以反映缺血性脑卒中的真实病理状态。本研究以具神经元特征的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，利用三气培养箱建立物理低氧低糖损伤模型，观察丹参素对神经细胞损伤作用的影响，并从氧化胁迫角度探讨其保护机制，比化学损伤更贴近于机体内环境。
       1 材料
       SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系由江苏省原子医学研究所卫生部核医学重点实验室谈成老师惠赠;丹参素由山东烟台靶点药物研究所提供，纯度99.8%;依达拉奉注射液为南京先声东元制药有限公司产品;超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，丙二醛(MDA)测试盒，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和考马斯亮蓝法蛋白浓度测试盒均为南京建成生工程研究所产品;磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)、吖啶橙(Acridine Orange，AO)、溴化乙啶(EB)均为SIGMA公司产品;MEM培养基为GIBCO公司产品;特级胎牛血清为杭州四季青生物工程公司生产;其余试剂均为国产分析纯。
       2 方法
       2.1 细胞培养和低氧低糖损伤模型的建立SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的MEM培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。低氧低糖时，细胞用不含葡萄糖、含10%胎牛血清的Earle"s balanced salt solution (BSSo)( mmol·L-1) ( NaCl 116，KCl 5.4，MgSO4 0.8， NaH2PO4 1.0，CaCl2 1.8，NaHCO3 26)，培养于37 ℃，1.5% O2，5%，CO2和94.5% N2的三气培养箱(Thermo Forma 3111)。
       2.2 SRB法测定存活细胞 SRB可使细胞蛋白染色，间接反映活细胞数量[7]。
       将1×105细胞悬液100 μl接种于96孔板内，正常培养24 h待细胞完全贴壁，分别加入终浓度为20，10，5，2.5，1.25，0.625 μg·ml-1的丹参素处理，置于另设正常培养对照和依达拉奉(100 μmol·L-1)作为阳性对照，每处理设3个平行孔。24 h后，轻轻吸去培养液(以测定LDH)，细胞以20%三氯醋酸4℃固定1 h，自来水冲洗5次后晾干，以0.4% (W/V) SRB(溶解于1%醋酸水溶液)染色30 min，以1% 醋酸冲洗4次，以洗掉未结合的染料，以10 mmol·L-1Tris碱溶液(pH 10)溶解结合的染料，用多功能酶标仪(Thermo 3001 VARIOSKAN FLASH)于492 nm波长下测定各孔吸光度。以未处理对照组细胞作为100%，计算各处理组细胞相对存活率。
       存活率(%)=处理组A未处理组A×100%
       2.3 乳酸脱氢酶(LDH)的测定乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯粽，在碱性溶液中成棕红色，通过比色可求出酶的活力。
       细胞培养液，离心(1 000 g，10 min)，取上清，按试剂盒说明书测定培养上清中LDH活力。
       2.4 细胞内SOD水平和MDA含量的测定如“1.3”项方法培养并处理细胞后，轻轻吸去培养液，加入50μl预冷的细胞裂解液(10 mmol·L-1 Tris，pH 7.4，100 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1 EDTA，1 mmol·L-1 EGTA，1 mmol·L-1 NaF，20 mmol·L-1 Na4P2O7，2 mmol·L-1Na3VO4，1% Triton X-100，2 μg·ml-1 Aprotinin，5 μg·ml-1Leupeptin)，于超低温冰箱(-80℃)冻融 2 次裂解细胞。收集细胞裂解液，4 ℃离心(10 000 g，10 min)，取上清，测定蛋白浓度。按试剂盒说明书测定各孔细胞裂解液中SOD活性和MDA含量。根据测试结果计算细胞内SOD活力和MDA含量。
       SOD(U·mg-1蛋白) =各孔SOD活性(U· ml-1)各孔蛋白浓度(mg·ml-1)
       MDA(nmol·mg-1 蛋白) =各孔MDA含量(nmol·ml-1)各孔蛋白浓度(mg·ml-1)
       3 结果
       3.1 细胞形态学变化SH-SY5Y细胞有神经瘤样细胞特征，含有小而圆的胞体，伸出较短的轴突，有较少的胞质和树突样突起(图1A)。低氧低糖处理24 h后，细胞皱缩，轴突和树突样突起消失，折光率增强(图1B)，依达拉奉(100 μmol·L-1)(图1C)和丹参素组处理后，细胞形态明显改善，高浓度丹参素(20 mg·L-1)组细胞形态几乎正常(图1D)。吖啶橙和溴化乙啶双染后，正常细胞不被溴化乙啶着色，被吖啶橙着色，胞质为绿色，核为显黄绿色，凋亡晚期细胞核可被染为红色，坏死细胞被染色均匀的红色。低氧低糖处理组多见细胞核固缩、核碎裂和凋亡小体出现，多数细胞发生脱核现象(图1F)，依达拉奉(图1G)和丹参素处理组较少见，丹参素20 mg·L-1处理组细胞形态与正常组细胞相似(图1H)。依达拉奉和丹参素各浓度对正常培养细胞未见明显影响。
       图1 低氧低糖损伤致SH-SY5Y细胞
       形态学改变和丹参素的保护作用(400×)
       3.2 细胞存活情况 SRB法测定结果(图2)表明，低氧低糖处理后，存活细胞数量明显降低，仅为正常培养对照组的30.0%(P<0.01)，给予依达拉奉或丹参素后，存活细胞数量明显增加，丹参素20 mg·L-1存活细胞数为损伤组的2.61倍(P<0.01)，2.5 mg·L-1丹参素组存活细胞数与依达拉奉组相当，5，10，20 mg·L-1各组明显高于依达拉奉组细胞数。
       与正常培养组比较：^^P<0.01;
       与低氧低糖损伤组比较，*P<0.05，**P<0.01;
       与依达拉奉对照组比较，##P<0.01
       图2 低氧低糖对细胞存活率的影响和丹参素的保护作用
       3.3 乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞经低氧低糖处理后，细胞发生坏死裂解，细胞内LDH的漏出，损伤组培养上清LDH水平为正常组的 3 倍(P<0.01)。依达拉奉或丹参素处理后，细胞培养上清LDH活性明显降低，且丹参素处理组具明显浓度依赖性，表明丹参素对细胞损伤有明显保护作用。丹参素高浓度(10 mg·L-1和20 mg·L-1)与依达拉奉作用相当(如图3)。
       3.4 丙二醛(MDA)含量的测定脑缺血可致严重的氧化胁迫，进一步诱导神经细胞发生凋亡，在缺血缺氧性脑病所致神经功能损伤过程起重要作用。低氧低糖处理体外培养的SH-SY5Y细胞后，细胞内的MDA含量明显增加(如图4)，表明细胞处于较严重的氧化胁迫状态。依达拉奉和丹参素干预后，可明显降低细胞内MDA含量，且丹参素作用具浓度依赖性，高浓度(10，20 mg·L-1)与依达拉奉无明显差异。
       3.5 超氧化物歧化酶(SOD)测定结果SOD是体内最重要的抗氧化酶，能清除超氧阴离子，对机体的氧化还原平衡起的调控作用。细胞低氧低糖后产生大量的自由基消耗SOD，可致SOD活性下降。实验结果表明，低氧低糖处理24 h可致细胞内SOD明显降低(P<0.01，见图5)。依达拉奉和丹参素均对SOD活性具明显保护作用，丹参素作用具有一定的浓度依赖性，丹参素高浓度优于依达拉奉。
       4 讨论
       SH-SY5Y 细胞来源于人的神经母细胞瘤，具神经元细胞特征，多被作为拟神经元，用以进行神经保护和神经退行性疾病的研究模型[8]。本实验以物理性低氧与低糖联合致其损伤为模型，较好地模拟了脑缺血所致神经损伤病理损伤过程。发现低氧低糖培养可致细胞LDH漏出增加，细胞内脂质过氧化产物MDA水平升高，SOD活性降低，与临床研究结果一致。丹参素对上述细胞损伤指标均有明显改善作用，且高浓度时优于依达拉奉组。有文献报道[9]，丹参注射液可明显减小急性脑缺血大鼠脑梗塞体积，降低血清MDA含量，升高血清SOD含量。本研究发现丹参中主要活性成分丹参素对低氧低糖损伤SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞具明显保护作用，可能与其直接清除细胞内氧自由基或对SOD起保护作用有关，支持了上述研究。
       研究结果提示丹参素对神经细胞损伤具有明显保护作用，具有一定的临床应用价值。丹参素神经保护作用确切的分子机制及其在整体水平的神经保护作用仍需进行深入研究探讨。
       【参考文献】
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