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       【摘要】 
       目的建立泸州纳溪GAP基地栀子药材高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。方法以栀子苷为参照物，采用Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脱，变波长检测。结果建立了纳溪栀子的HPLC指纹图谱，并确定了19个共有峰，共有峰的参数符合“中药注射剂指纹图谱技术要求”的有关规定。结论方法准确，重复性好，建立的指纹图谱检测标准，可作为纳溪栀子质量评价与品种鉴别的重要依据之一。
       【关键词】  栀子; HPLC; 指纹图谱; 可变波长
       栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效[1]。栀子主要含两类有效成分：环烯醚萜苷(栀子苷、京尼平龙胆二糖苷、异栀子苷、栀子酸等)和藏红花素(西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ、西红花酸等)[2]。由于两类成分最大吸收波长分别在240 nm和440 nm，其紫外吸收光谱扫描显示几乎无交叉吸收区域，要让两类成分均在同一指纹图谱中反应出来，需用可变波长技术，分别在二者最大吸收波长处检测。目前国内文献关于栀子的指纹图谱研究多为采用单一波长或多波长检测，分别建立环烯醚萜类和藏红花素类的指纹图谱[3～5]，此方法不能反映栀子的整体指纹特征。栀子主要生长在长江以南各省，主产于浙江、江西、湖北、湖南、四川等地，四川纳溪栀子以品质高而闻名，全区种植面积约2 000 ha，年产量近1 000吨。不同来源的栀子，由于受到产地、气候、采收时间及加工方法的影响，致使其有效成分的含量存在着一定的差异，从而影响其临床疗效。为全面评估四川纳溪地区栀子有效成分的变化及差异，试验采用二极管阵列检测器的可变波长检测功能，分别在环烯醚萜类和藏红花素类的最大吸收波长处测定，建立了泸州纳溪GAP基地栀子的HPLC指纹图谱，为其质量控制、药材鉴别以及进一步开发利用本地区的栀子资源提供科学依据。
       1 仪器与试药
       戴安高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站);瑞士Precisa电子天平(XR 205SM-DR);CQX25-06超声波清洗器(上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 kHZ)。
       栀子苷对照品，纯度>98.0%，中国药品生物制品检定所提供。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。栀子10批，2008-11采至四川省泸州市纳溪区大渡口栀子GAP基地，经作者鉴定为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的果实。
       2 方法与结果
       2.1 色谱条件 色谱柱：Dikma Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液，梯度洗脱：0 min→20 min→50 min，乙腈5%→15%→45%;检测波长：0～30 min，240 nm，30～50 min，440 nm;柱温：35℃;流速：1.0 ml·min-1;进样量：10 μl。理论塔板数按栀子苷计不低于5 000。
       2.2 溶液的制备
       2.2.1 参照物溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶解制成每毫升含栀子苷0.306 mg的对照品溶液。
       2.2.2 供试品溶液的制备 取本品细粉约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，称定重量，超声处理45 min，取出，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得。
       2.3 稳定性实验取供试品溶液，分别于制备后0，4，8，16，24，48 h检测指纹图谱。以栀子苷峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间及13号色谱峰的峰面积比值基本一致，其RSD均小于3%，相似度均在0.99以上。符合指纹图谱的技术要求[6]，表明供试品溶液在48 h内稳定。
       2.4 精密度实验取供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱。各共有峰的相对保留时间及13号色谱峰的峰面积比值基本一致，其RSD均小于3%，相似度均在0.99以上。符合指纹图谱的技术要求，表明仪器精密度良好。
       2.5 重复性实验取栀子样品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别检测指纹图谱。以栀子苷峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰的相对保留时间及13号色谱峰的峰面积比值基本一致，其RSD均小于3%，相似度均在0.99以上，符合指纹图谱的技术要求，表明本方法重复性较好。
       2.6 指纹图谱的建立及共有指纹峰的标定 精密吸取栀子苷参照溶液和栀子供试品溶液10 μl，分别注入液相色谱仪，记录50 min的色谱图，即得。比较不同批次样品的色谱图，其中19个色谱峰是共有的，确定为共有指纹峰，见图1。
       图1 栀子标准指纹图谱
       2.7 共有指纹峰技术参数的确定 比较10个批次栀子样品的色谱图，根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[6]，以栀子苷峰作为参照峰(S峰)，计算各共有指纹峰的保留时间、相对保留时间、峰面积、峰面积百分比和峰面积比值，见表1。结果表明各共有指纹峰的相对保留时间、峰面积比值相对固定，符合《中药注射剂指纹图谱的技术要求》[6]。
       2.8 指纹图谱的相似度评价 根据《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)》[7]，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版(国家药典委员会)对10批栀子药材的指纹图谱进行相似度分析，以第1批药材的指纹图谱作为参照谱图，以平均数法生成10批药材的对照指纹图谱，10批栀子与对照指纹图谱相似度分别为：0.972，0.968，0.985，0.993，0.998，0.998，0.997，0.998，0.989，0.996。符合指纹图谱技术要求。10批栀子HPLC指纹图谱叠加图见图2。表1 栀子HPLC指纹图谱技术参数
       3 讨论
       实验中曾选择了多组流动相系统，结果表明，各组流动相中以乙腈-0.05%磷酸溶液作正文梯度洗脱最佳，能保证栀子药材中绝大部分色谱峰都能获得良好的分离，可用于指纹图谱分析，同时该色谱条件也适合栀子药材中各主要成分的含量测定。
       实验采用二极管阵列检测器在190～600 nm范围内分别扫描供试品溶液中各成分的紫外吸收，试验发现30 min前的所有色谱峰均在240 nm左右有最大吸收，而30 min后的所有色谱峰均在440 nm有最大吸收，由于二类成分几乎无交叉吸收区域，采用单一波长检测会导致某些主要活性成分色谱峰相对丰度降低甚至丢失，故根据两类成分保留时间的差异，在30 min前以240 nm检测环烯醚萜苷类，在30 min后以440 nm检测西红花苷类，使两类成分均可获得较强的丰度，以体现药材的整体指纹特征。
       通过实验研究，纳溪大渡口栀子GAP基地所产10批栀子药材HPLC指纹图谱相似度较高，均大于0.95，说明其化学组成一致性较好，质量稳定。该产地的药材作投料药材用，可保证药品质量稳定可控。该方法也可作为该地区栀子药材品质及真伪鉴别的依据。
       【参考文献】
         　[1] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：173.
       
       [2] 谢学峰，张俊慧，马爱华.中药栀子研究进展[J].时珍国医国药，2000，11(10):943.
       
       [3] 韩建萍，陈士林，张文生，等.不同产地栀子药材HPLC指纹图谱研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2007，9(4):56.
       
       [4] 郑云枫，彭国平.栀子药材HPLC指纹图谱的研究[J].南京中医药大学学报，2005，21(1):45.
       
       [5] 曹 敏，陈玉英.栀子药材西红花苷类HPLC指纹图谱的研究[J].中国新药杂志，2003，12(7):553.
       
       [6] 国家药品监督管理局. 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)[J].中成药，2000，22(10)：671.
       
       [7] 国家药典委员会.中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)[S]..2002.