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       【摘要】 
       目的研究五鹤续断快繁体系关键技术的建立和优化。方法以五鹤续断(Wu-He Dipsacus asper)初春萌发的幼嫩茎、茎尖和叶作为外植体，对五鹤续断愈伤组织的诱导及根和芽分化的培养基进行优化筛选。结果诱导愈伤组织的最适培养基为MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1，在光照下培养长势好;诱导丛生芽的最优培养基为MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1;诱导生根的最佳培养基为1/2MS+NAA1.0 mg·L-1+ PP3 330.4 mg·L-1。结论 建立了一套五鹤续断快速繁殖技术体系。
       【关键词】  五鹤续断; 愈伤组织; 芽和根的分化; 快速繁殖技术
       五鹤续断(Dipsacus asper)属于川续断科植物，药用部位为其干燥根，因其产地以湖北鹤峰县、五峰县为主，并且是川续断中的优质品[1]，具有补肝益肾、续接筋骨、抗骨质疏松、止血安胎等功效，临床上主要用于治疗腰膝酸软，跌打损伤，骨折，腰椎骨质增生，先兆性流产和习惯性流产等症状[2]。
       到目前为止，五鹤续断组织培养的研究国内外均未见报道。本研究用茎尖及多种外植体为研究材料，茎尖组织可解决退化问题，在组织细胞培养条件的选择及快速繁殖方面进行了一些探讨，旨在为其扩大种植提供一条有效途径，为进一步采用生物技术进行多倍体诱导作好技术准备，并为进一步研究提取五鹤续断次生代谢产物提供实验材料。
       1 材料
       本实验所用五鹤续断均来自恩施州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究基地，为了取材方便，将其移至生物资源保护与利用重点实验室(湖北民族学院)植物培养室和温棚精心培育。
       2 方法
       2.1 外植体处理挑选五鹤续断当年初春萌发的幼嫩的健壮植株，取其幼嫩的茎、叶作为外植体，用软毛刷在稀释的洗洁净中轻轻刷洗后，流水冲洗2～3 h，用滤纸吸去多余的水分，在超净工作台上用75%的酒精中浸泡30 s左右，无菌水冲洗5遍，再转入0.1%的升汞溶液中振荡消毒：茎8 min，叶6 min，无菌水冲洗5～6次，然后置于高压灭菌过的铺有滤纸的培养皿中，切除药液接触过的伤口并除去茎的外表皮，切成0.3～0.5 cm长的小段，叶切成0.5 cm见方的正方形，接种于附加不同植物生长调节物质及其组合的MS培养基上，诱导愈伤组织。所有MS培养基中均添加6.5 g·L-1琼脂和30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。
       2.2 愈伤组织的诱导和增殖
       2.2.1 愈伤组织的诱导消毒后的外植体接种于MS培养基上，研究附加不同植物生长调节物质及其组合之后对外植体愈伤组织的诱导效应，筛选出愈伤组织诱导的最佳培养基。每个处理10瓶，每瓶4块外植体，30 d后测出愈伤组织块数和生长率。按下式计算诱导率：
       诱导率(%)=形成愈伤组织的外植体块数接种外植体的块数×100%
       2.2.2 愈伤组织的增殖用诱导愈伤组织的最优培养基进行继代培养。每瓶接种鲜重1 g且色泽均匀一致的愈伤组织，分两批培养：一批置于暗培养箱中;另一批置于光强为40 μmol·m-2·s-1， 12 h·d-1，温度为25℃左右条件下培养。接种后，每3天取不同条件下培养的愈伤组织称重，计算愈伤组织的生长量(鲜重)，实验重复3次，取其平均值，绘出愈伤组织的增殖曲线。
       2.3 诱导丛生芽的培养基优化实验设计NAA(0.1，0.3，0.5，0.7，1.0)mg·L-1 和6-BA(1.0，1.5，2.0)mg·L-1进行配比，添加到MS培养基诱导丛生芽的产生。每个处理10瓶，每瓶放4块生长较好的愈伤组织，30 d后测定平均出芽数。
       2.4 生根培养基的优化芽苗长至约2 cm高时，剪下单根芽苗转入含6.5 g·L-1琼脂、30 g·L-1蔗糖、pH 5.8的附加激素(NAA和多效唑)1/2MS培养基中进行培养。每个处理10瓶，每瓶放3根芽苗，30 d后测定平均生根数。
       2.5 培养条件以上实验的培养条件均为培养温度23～25℃，光照强度40 μmol·m-2·s-1，光照时间12 h·d-1。
       3 结果与讨论
       3.1 不同植物生长调节物质及其组合对愈伤组织诱导的效应
       3.1.1 NAA、2,4-D、6-BA和KT对五鹤续断愈伤组织的诱导率及其生长势的影响由单因子实验可知(见表1)，NAA对五鹤续断愈伤组织的诱导效果显著，当浓度为1.0 mg·L-1时诱导率最高(65.4 %)，其愈伤组织成碧绿色、疏松状，且生长势也较好;2,4-D对五鹤续断愈伤组织的诱导效果较好，愈伤组织为淡绿色，质地较硬。当浓度为1.0 mg·L-1其诱导效果最佳，生长势较好，但愈伤组织边沿出现了不同程度的溶解状态，可能是由于内生菌生长的缘故;6-BA对五鹤续断愈伤组织的诱导也较好，在浓度为1.5 mg·L-1时，其诱导率最高(67.2%)，其愈伤组织的为淡绿色、疏松状，其生长势比NAA的生长还要好，但都有不同程度的褐化现象;KT对五鹤续断愈伤组织的诱导效果不明显，生长势也差，其浓度为0.5 mg·L-1时诱导率最高(仅35.2%)，愈伤组织为黄白色，有轻微的褐化现象。
       3.1.2 不同植物生长调节物质组合对五鹤续断愈伤组织的诱导效应在单因子试验的基础上, 实验了NAA+6-BA、2,4-D+6-BA以及NAA +2,4-D+6-BA 3种组合对愈伤组织诱导及生长的影响。研究结果表明(见表2)，3种激素组合均可诱导出愈伤组织，6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1组合和6-BA1.0 mg·L-1+2,4-D2.0 mg·L-1对五鹤续断愈伤组织的诱导率较高，分别达到了89.5%和92.7%，但前者所得愈伤组织呈深绿色、质地好，生长旺盛，这种愈伤组织适合于快速繁殖。因此，诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA1.5 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1。表1 NAA、2,4-D、6-BA和KT对五鹤续断的愈伤组织的诱导效应表2 不同植物生长调节物质组合对五鹤续断愈伤组织的诱导效应
       3.2 不同外植体愈伤组织的诱导研究结果显示(见表3)，叶、幼嫩的茎段和茎尖都能诱导出语伤组织，但不同类型外植体诱导愈伤组织的效果不同，其中以茎尖和幼嫩的茎段诱导愈伤率较高，生长势好;叶诱导愈伤率较低。而茎尖培育的幼苗可脱毒，达到防止品种退化的目的，因此，选取茎尖作为外植体进行快速繁殖较理想。表3 不同外植体愈伤组织的诱导
       3.3 愈伤组织的增殖五鹤续断愈伤组织在黑暗和光照培养条件下的增殖情况见图1。由图1可知，其愈伤组织生长曲线均呈“S”型, 符合Logistic Growth Model生长模型[3]。可明显地分为3个时期：延迟生长期(0～9 d)、指数生长期(9～24 d)和静止(24～30 d)期。愈伤组织在延迟期生长缓慢，可能是由于刚接种的愈伤组织需要一段时间来适应新的环境，才能较好地吸收营养物质;在指数生长期愈伤组织鲜重急剧增加;在静止期愈伤组织鲜重增加几乎停止，这可能是因为培养基中养分几乎消耗殆尽, 不能提供其增殖所需的营养物质的缘故。
       通过光培养和暗培养两种培养条件的比较可知，愈伤组织在光照下长势好，愈伤组织的颜色呈深绿色, 结构较疏松;在暗培养中，愈伤组织呈黄白色，长势较慢。
       3.4 诱导丛生芽培养基的优化研究结果表明(见表4)，以茎尖愈伤组织为诱导丛生芽材料，激素配比为6-BA2.0 mg·L-1和NAA0.5 mg·L-1时诱导丛生芽数最高，芽苗健壮，由此筛选出诱导丛生芽的最优培养基为MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。表4 不同激素配比诱导丛生芽的效果
       3.5 生根培养基的优化研究激素水平对五鹤续断诱导生根的影响，结果表明(见表5)：单独使用NAA时可以诱导生根，以浓度为1.0 mg·L-1时最佳;但在培养基中添加多效唑(PP333)后可促进生根，PP333浓度为0.4 mg·L-1时效果最佳。综合考虑因素NAA和PP333，诱导生根的最佳培养基为1/2MS+NAA1.0 mg·L-1+ PP 3330.4 mg·L-1。表5 不同激素配比诱导生根的效果
       3.6 炼苗与移栽在试管苗高5～6 cm，根长约3 cm时移栽，先打开培养瓶盖，置于室温散射光下，补加适当的蒸馏水，炼苗3～4 d后取出试管苗，洗去根部培养基，移栽入装有50倍的MS营养液花盆中，用海绵固定小苗，放在温棚中培养，湿度保持 90%左右，3周后移栽。预先在花盆表面喷洒1次多菌灵，栽好后再喷1次;移栽后每天至少两次喷洒适量水(土润湿为止)，移栽后的小苗注意遮荫、保湿、适当通风，小苗成活率可达85%。
       4 结论
       以MS培养基作为基本培养基，以茎尖、幼嫩茎段、叶片作为外植体，均可诱导出愈伤组织，前两种愈伤组织诱导率较高，茎尖产生的愈伤组织生长较好，可避免内生菌的产生，是防止品种退化的最有效途径。进一步研究显示，诱导丛生芽的最优培养基为MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1，诱导生根的最佳培养基为1/2MS+NAA1.0 mg·L-1+ PP 3330.4 mg·L-1。
       【参考文献】
         　[1] 武 芸,丁 莉,周吉源. 五鹤续断的研究概况与开发前景[J].湖北民族学院学报(医学版),2004,21 (4):31.
       
       [2] 全国中草药汇编写组.全国中草药汇编，下册[M].北京:人民卫生出版社,2000：135.
       
       [3] 胡玉佳. 现代生物学[M].北京:高等教育出版社,2004：3.