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       【摘要】 
       目的探讨中草药干品和鲜品总DNA的提取方法，并比较干、鲜品总DNA质量之间的差别，为后续研究奠定基础。方法分别采用SDS法和改良的CTAB法提取6种中草药干品和鲜品总DNA,并对其进行核酸含量测定、电泳检测和酶切反应检测。 结果改良CTAB法提取的DNA质量要高于SDS法，在干品和鲜品样品间,干品提取的DNA质量要高于鲜品。利用CTAB法提取鲜品和干品的各6种DNA样品，进行酶切反应得到了清晰的酶切条带。结论改良的CTAB法能够获得高质量的中草药总DNA，且该方法得到的干品DNA比鲜品DNA质量更高，酶切验证二者都可以用于进一步的实验分析。
       【关键词】  DNA提取； SDS法； CTAB法； 液氮
       Total Genomic DNA Extraction from Dried and Fresh Herbs and Quality Comparison
       YAO Qingshou，  LIU Xiuzhen，   WU  Yuyong，     JIANG Jilai
       （Department of Genetic Engineering and Molecular Biology, Binzhou Medical College, Yantai，264003 China  ）
       Abstract：ObjectiveTo explore the best total genomic DNA extraction method from the dried and fresh herbs, and to compare the DNA quality as a foundation for future research. MethodsSDS and modified CTAB methods were used to get DNA, and the content of nucleic acid, and agarose gel electrophoresis and enzyme digestion were used.ResultsDNA was higher quality using modified CTAB method to extract, and could get higher quality of total genomic DNA from dry samples. It showed a clear enzyme digestion bands using six kinds of DNA by modified CTAB method extracted from fresh and dried samples of herbs. ConclusionIt can be get high-quality of total genomic DNA by the modified CTAB method，and can be used for further experiment analysis.
       Key words：DNA extraction;   SDS method;   CTAB method;   Liquid nitrogen
       
       近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已被广泛用于药用植物遗传多样性、系统学、分类学研究，并逐渐渗透到中草药的鉴定领域，推动了中草药鉴定研究的发展［1］。如何快速提取纯净、完整的大分子DNA也是进行核苷酸序列测定，基因文库构建, PCR扩增及RAPD鉴定的基础和关键［2］。中草药细胞通常含有大量的多糖,脂质,色素和酚类物质,严重影响了DNA的提取与纯化, 同时这些物质若与DNA结合则也会影响后续实验操作。目前植物总DNA的提取方法已有很多的报道,但多见于仅对某一植物而论，目前在中草药领域尚无通用的植物DNA 提取方法,需视材料情况进行探索［3，4］。我们选取了不同种的6种草药，并分干品和鲜品，采用改良的CTAB法和SDS法，并在实验过程中不断调整实验步骤，分别提取这6种药材的DNA, 通过DNA质量检测、凝胶电泳检测和酶切鉴定，以期确定一种可以对多种草药进行总DNA提取的方法，为后续分子生物学的研究奠定基础。
       1  材料
       1.1  药材
       所有供试样品（冬青、紫苏、小蓟［5］、杜鹃、益母草［5］、艾草，按上述顺序编号为1～6号）都采自滨州医学院烟台校区校园，采取鲜嫩的叶片或全株植物，用自来水流水冲洗10 min后，用无菌蒸馏水冲洗2～3次，一部分鲜嫩材料直接用于提取DNA，另一部分放进烘箱内于50℃烘干后，再进行DNA提取。
       1.2  仪器
       电热鼓风干燥箱，灭菌锅，冰箱，DYY-11B型三恒电泳仪，恒温水浴锅，离心机，天能紫外凝胶成像系统等，均为国产，核酸蛋白定量分析仪为Eppendorf公司生产。
       1.3  试剂
       EDTA 、CTAB、琼脂糖、Marker、等分子生物学常用试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他常用试剂为国产分析纯。
       2  方法
       2.1  CTAB法参照文献［6，7］，并进行调整，简称改良CTAB法，具体步骤：2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热；取少量叶片或全草置于研钵中，用液氮（或不用液氮）磨至粉状；取少量粉末速转入至预冷的离心管中（约占离心管的1/3高度）, 加800 μl冰预冷的 STE 缓冲液迅速混匀, 放置 2 min 后, 4℃ 3 000 r/min, 离心 4 min, 弃上清。重复 1 次, 得沉淀；加入700 μl的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔5 min轻轻摇动，30 min后取出；冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24∶1）至满管，剧烈振荡2～3 min，使两者混合均匀；放入离心机中10 000 r/min,15℃以上离心1 min后，轻轻地吸取上清液，转入新灭菌的离心管内，然后加入600 μl的异丙醇，将离心管慢慢上下摇动30 s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；10 000 r/min离心1 min后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；1 min后，加入800 μl 75%的乙醇，洗涤DNA；10 000 r/min离心30 s后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；自然风干DNA；加入500 μl TE缓冲液溶解，1%琼脂唐凝胶电泳检测，余下样品置于-20℃保存备用。根据是否用液氮研磨样品，区分为改良CTAB法A（用液氮研磨样品）和改良CTAB法B（不用液氮研磨样品）。
       2.2  SDS法参照文献［6］，并调整：取少量叶片或全草置于研钵中，用液氮磨至粉状；加入600 μl提取缓冲液，轻轻混匀。向管中加入50 μl 20% SDS溶液，轻轻混匀， 65℃保温15 min，期间间隔晃动3～4次。加入150μl 5 mol/L KAc，混匀，置冰上30 min。4℃,10 000 r/min离心15 min,转移上清到另一离心管中，加入2/3V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。10 000 r/min离心10 min回收总DNA沉淀，加入800 μl 75%的乙醇，洗涤DNA；10 000 r/min离心30 s后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；自然风干DNA；加入500 μl TE缓冲液溶解，1%琼脂唐凝胶电泳检测，余下样品置于-20℃保存备用。
       2.3  DNA浓度及其纯度检测
       2.3.1  DNA 浓度测定对提取的DNA，用500 μl TE溶解，取 20 μl 的DNA 溶液和 980 μl 的超纯水于石英比色皿中混匀, 以超纯水为空白, 测定OD260/OD280的比值, 并按总DNA 浓度(μg/ml)=OD260×50×稀释倍数计算各种方法提取样品的DNA 浓度。
       2.3.2  电泳检测配制1.0%(W/V) 的琼脂糖凝胶, 将上述方法提取的总DNA 吸取10  μl 点样, 于0.5×TBE 缓冲液中电泳, 电场强度为5 V/cm。待溴酚蓝迁移至琼脂糖一多半处时, 取出胶, 用溴化乙锭（EB）染色10 min，在凝胶分析系统中观察并拍照。
       2.4  酶切反应鉴定DNA质量分别取以改良CTAB法提取的6种中草药的干、鲜品总DNA溶液用RNA酶消化后作为模板，以上海生工生产的Hind Ⅲ和Xho I核酸酶进行酶切。37℃ 20 μl 反应体系，酶切4 h后，电泳检测。反应体系中各物质量如表1。表1  反应体系中各物质量（略）
       3   结果
       3.1  DNA浓度测定结果
       3.1.1  不同方法提取的DNA质量纯度不同方法提取的DNA质量纯度有明显的差异，以OD260/OD280比值进行比较，如表2所示，数值为DNA提取3次后，测量的OD260/OD280比值的平均值，其中“-”表示比值偏离太大，弃用。表2  不同方法提取的总DNA质量（以OD260/OD280值表示）（略）
       
       结果显示改良CTAB法A提取的DNA质量要高于SDS法，改良CTAB法A提取的DNA质量要高于改良CTAB法B提取的DNA；而用改良CTAB法提取，在干品和鲜品样品间干品提取的DNA质量要高于鲜品；利用SDS法提取的DNA虽然都用液氮对样品进行了研磨，但是获得的DNA质量要低于改良CTAB法提取的，从测量的结果看表明在提取的DNA溶液中含有大量的蛋白质、多糖类等杂质；如果不用液氮研磨样品，CTAB法对鲜品DNA的提取质量很低［纯DNA，OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）］。
       3.1.2  不同方法提取的DNA含量对提取的DNA，以500 μl  TE溶液溶解，分别取20 μl  DNA溶液用无菌双蒸水稀释50倍，测其DNA含量如表3。表3  不同方法提取的总NDA的含量（略）
       
       不同方法提取的DNA含量也有明显差异，改良CTAB法提取的DNA中，鲜样品中提取的DNA含量要高于干品提取的含量，SDS法提取的DNA含量和CTAB法提取的鲜品样品DNA含量无明显差异。而在SDS法提取的干品和鲜品样品DNA含量之间差异不明显。
       3.2  电泳检测结果1～6号样品各取10 μl进行琼脂糖凝胶电泳, 用改良CTAB法A提取鲜品样品DNA的电泳图显示条带清晰无拖尾现象（见图 1 ）；用改良CTAB法A提取干品样品DNA的电泳图显示清晰无拖尾现象，但条带要暗于鲜品，说明DNA含量要低于鲜品提取的DNA含量，也与测定的DNA含量结果相符（见图 2）；用改良CTAB法B对干、鲜品样品提取DNA的电泳图显示，没有用液氮研磨提取的DNA质量有所下降，有明显的拖尾，这也同紫外核酸蛋白仪器测定的结果相符（见图 3）。用SDS法对干、鲜品样品提取DNA的电泳图显示提取的DNA质量要低于改良CTAB法A，但高于改良CTAB法B对鲜品样品提取DNA的质量（见图 4）。
       3.3  酶切检测DNA质量结果根据“3.1”和“3.2”的实验结果，本实验选取用改良CTAB法A提取的鲜品和干品的6种DNA样品，通过酶切反应后，得到了清晰的酶切图谱（见图 5），说明通过本实验探索的改良CTAB法A提取的DNA质量较好，可以进一步进行DNA的实验分析。
       4  讨论
          
       植物药中的小分子次生代谢产物如萜类、黄酮、香豆素、有机酸、鞣质等含有酚羟基的化合物，氧化后易与DNA结合,引起DNA降解或抑制酶的活性，而植物中存在的多糖类由于与DNA同属大分子化合物，一般提取过程很难去除干净,也可能影响DNA的进一步酶处理或PCR扩增［4，8～11］。不同研究显示采用改进的CTAB法对单一中草药基因组DNA进行提取,都能多得高质量的DNA［12，13］。本实验采用改良CTAB方法，先用预冷的STE抽提液进行处理,能很好的除去多糖；采用15℃以上离心可以避免低温环境下CTAB与植物材料共沉淀，从而降低DNA抽提效率；提取过程中取的研磨粉末量要少，一则细胞裂解充分，二则可避免后续实验获得的上清液量少，保证提取的DNA的量；同时，同为改良CTAB法，唯一区别在是否用液氮研磨材料，对实验的结果影响明显，一般的中草药都比较难以研磨，鲜材料更加如此，如何快速的得到材料的细粉也极为关键，研磨时间过长，极易造成DNA降解。实验表明，液氮研磨可以起到很好的保护作用，得到的DNA质量高。同时在提取时加入2%或更高量的β-巯基乙醇也有助于获得高质量的DNA。在用异丙醇沉淀DNA时，当有絮状沉淀出现时，用玻璃棒把絮状沉淀挑出，而不用离心沉淀的方式，能够获得更纯的DNA。本实验显示改良CTAB 法为简便、实用的中草药总DNA提取方法。
       
       本实验显示干品比鲜品获得的DNA质量要高，可能通过干燥，细胞内含水量少，部分酶的活性降低，在提取过程中对DNA的分离造成的干扰变小，更有利于DNA的分离。    本实验对上述6份材料DNA样品进行了酶切分析，能获得清晰的酶切图谱，说明无需复杂的纯化过程，只需简单的氯仿：异戊醇 (24∶1)抽提，获得的DNA完全可以用于进一步DNA实验分析，但采用液氮研磨是个比较关键的步骤。
       
       本实验利用SDS法进行DNA的提取，发现提取的DNA颜色发黄或褐色，不容易去除色素、蛋白等杂质，DNA质量检测显示OD260/OD280比值偏低，在操作过程中通过改用苯酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）进行抽提，仍不能有效去除色素、蛋白质等杂质。而有人在玄参中利用SDS法获得了较好质量的DNA［14］，与本实验有一定的差异，说明SDS法也是一种潜在的提取高质量的DNA的方法，可能需要进一步探索改变其中的一些关键步骤。
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