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       【摘要】 
       目的观察蛋白激酶C（PKC）-细胞外信号调节激酶（ERK1/2）信号通路在血管再狭窄中的表达及川芎嗪对其的影响。方法制备大鼠血管再狭窄模型，采用川芎嗪干预，观察颈总动脉形态学变化，免疫组化法检测血管PKCζ与ERK1/2表达。结果假手术组动脉结构正常、清晰，无明显VSMC增殖，颈总动脉损伤大鼠血管内腔面粗糙，中层VSMC大量增殖，内膜增厚，川芎嗪处理后VSMC增殖程度降低；与假手术组比较，手术组血管壁PKCζ与ERK1/2表达显著增高（P<0.01）；与手术组比较，川芎嗪中、高剂量组PKCζ与ERK1/2表达显著降低（分别P<0.01，P<0.05），川芎嗪中、高剂量组PKCζ与ERK1/2表达较川芎嗪低剂量组相比亦有显著降低。结论PKCζ-ERK1/2信号通路参与血管再狭窄的形成，川芎嗪可通过抑制该通路实现抗血管再狭窄的作用。
       【关键词】  川芎嗪； 血管再狭窄； 蛋白激酶C； 细胞外信号调节激酶
       经皮穿刺冠状动脉腔内成形术是治疗冠心病的重要措施之一，但是术后仍有30%～50%的患者发生血管再狭窄，严重影响了患者术后的远期疗效。目前认为血管再狭窄的主要病理特征之一是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）大量增殖。我们先前的研究显示［1］，内皮素、血管紧张素Ⅱ以及血小板源生长因子与血管平滑肌细胞增殖密切相关，在血管再狭窄形成中发挥重要作用。研究显示［2～4］，胞浆内蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）与细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK 1/2）构成的信号通路参与内皮素、血管紧张素Ⅱ及血小板源生长因子的胞内信号传递。本实验以颈总动脉损伤大鼠为模型，在整体水平上观察血管再狭窄时PKCζ-ERK1/2通路的变化以及川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)对该通路的影响，探讨血管再狭窄的发生机制，并为防治血管再狭窄提供实验依据。
       
       1  材料与方法
       1.1  动物模型与实验分组   
       参照文献制备颈总动脉狭窄模型［5］。体质量在280～300 g的健康雄性SD大鼠50只（河南省实验动物中心），随机分为①手术组：戊巴比妥钠腹腔麻醉后，用两片已消毒夹板分别置于动脉上、下侧，止血钳持续钳夹25 min后松开，移去夹板。缝合伤口，回笼饲养。②TMP低剂量组：于术前3 d开始腹腔注射盐酸川芎嗪溶液（无锡市第七制药有限公司）20 mg/（kg·d）。③TMP中剂量组：于术前3 d开始腹腔注射盐酸川芎嗪溶液60 mg/（kg·d）。④TMP高剂量组：于术前3 d开始腹腔注射盐酸川芎嗪溶液100 mg/（kg·d）。⑤假手术组：左侧颈总动脉不上夹板，余操作同手术组。
       1.2  组织学研究手术14 d处死大鼠，取左侧颈总动脉，4%多聚甲醛固定，然后经包埋、切片、苏木素-伊红染色后，在光镜下观察。
       1.3  测定血管PKCζ与ERK1/2的表达
       采用免疫组化法：切片厚度0.6 μm、脱蜡至水，PBS冲洗，3%H2O2灭活内源性酶，正常山羊血清封闭20 min，分别加入PKCζ与ERK1/2抗体（武汉博士德 ）4℃过夜，复温1 h，PBS 冲洗后，加入生物素化二抗孵育37℃ 30 min，PBS冲洗，滴加 SABC，PBS冲洗。最后DAB显色，脱水、透明，中性树胶封片。采用HPIAS-10009型计算机图像分析系统（郑州太阳电子科技公司）测定平均灰度值，每张切片随机选４个视野，得其平均灰度值总数，然后取平均值。
       1.4  统计学处理
       所有数值均以±s表示，采用SPSS11.0计算机统计软件。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。
       2  结果
       2.1  形态学观察假手术组颈总动脉各层结构正常、清晰, 无明显VSMC增殖；手术组血管内腔面粗糙，中层VSMC大量增殖并向内膜下迁移，内膜增厚；中、高剂量TMP处理后VSMC增殖程度降低。
       2.2  血管PKCζ与ERK1/2的表达 
       与假手术组相比，手术组大鼠颈总动脉VSMC PKCζ与ERK1/2表达显著增强（P<0.01）；与手术组相比，TMP低剂量组PKCζ与ERK1/2的表达无显著差异，但有减弱趋势；TMP中、高剂量组PKCζ的表达明显降低（P<0.01），ERK1/2表达亦明显降低（P<0.05）。并且与TMP低剂量组相比亦有显著差异。结果见表1。表1  TMP对颈总动脉损伤大鼠血管PKCζ与ERK1/2表达的影响（略）
       
       3  讨论
          
       川芎嗪是从伞形科植物川芎根茎中分离提纯的有效成分，其化学结构为四甲基吡嗪，广泛用于高血压、冠心病等疾病的预防与治疗。研究表明［6］川芎嗪具有扩张冠状动脉、抗凝、抗血小板聚集、抗心肌缺血/再灌注损伤、降低血压、降低肺动脉高压等多种心血管药理作用。川芎嗪可能通过抑制VSMC增殖发挥抗血管再狭窄作用，但其作用机制尚不完全清楚。
       
       本实验结果显示，手术组颈总动脉VSMC大量增殖并且向内膜下迁移，血管PKCζ与ERK1/2的表达显著增强。VSMC增殖是血管再狭窄主要的病理特征之一，多种细胞外信息分子可经过胞内信号转导系统，将刺激信号传递到核内，诱导一系列与VSMC增殖相关的基因活化、蛋白质合成，最终导致VSMC增殖。其中丝裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)是一簇细胞内广泛存在的含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶超家族，是多种促细胞增殖信息传递的共同通路或称会聚点，是细胞表型变化和增殖的关键酶。PKC 静息状态下主要以无活性的状态存在于胞浆中，分为α、β、ζ等多种亚型，是细胞内信息传递中的重要分子。PKC受到外界刺激时通过上游信号分子的磷酸化作用使其构象改变而激活，PKC作为MAPK的上游信号分子，PKC可通过激活MAPK级联反应，将信息传递到核内，从而实现细胞内的信号转导和细胞核内基因转录的活化,产生相应的生物学效应。ERK1/2属于MAPK家族中一个重要成员。有文献报道［7，8］, PKC活化后可以激活ERK1/2并使其转位入核, 激活多种转录因子，引起基因转录和蛋白质合成，导致VSMC的增殖和肥大。提示PKCζ-ERK1/2通路在VSMC增殖中发挥了重要作用。结合本实验推测，在整体水平上，PKCζ-ERK1/2信号通路参与血管再狭窄的形成。
       
       本实验中，应用中、高剂量川芎嗪处理后，颈总动脉VSMC增殖程度减轻，血管PKCζ与ERK1/2的表达显著降低，并且与川芎嗪低剂量组相比亦有显著差异，说明川芎嗪的作用具有剂量依赖性。体外细胞培养实验显示,川芎嗪可以抑制血管平滑肌细胞增殖［9］。结合本实验提示，川芎嗪可通过抑制PKCζ-ERK1/2通路实现抗血管再狭窄的作用。
       
       综上所述，PKCζ-ERK1/2信号通路参与血管再狭窄的形成，川芎嗪可能通过抑制该通路实现抗血管再狭窄的作用。
       【参考文献】
         　［1］孙银平，王省，张大伟，等. 川芎嗪对大鼠颈总动脉损伤后ET、AngII与血小板源生长因子表达的影响［J］. 时珍国医国药,2009,20（3）：277.
       
       ［2］朱肖星,梅其炳,刘莉，等.内皮素-1对新生大鼠心肌细胞的影响及机制［J］.心脏杂志，2005，17（5）：441.
       
       ［3］张翠,田陈,郭焕，等. 糖尿病大鼠肾小管VEGF表达的动态观察及其与AngⅡ、PKC、ERK关系的研究［J］.中国现代医学杂志，2008，18（3）：313.
       
       ［4］Kim TJ, Yun YP. Antiproliferative activity of NQ304, a synthetic 1,4-naphthoquinone, is mediated via the pressions of the PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways in PDGF BB-stimulated vascular smooth muscle cells［J］.Vascul pharmacol, 2007,46(1):43.
       
       ［5］徐红岩，周序斌，胡茂稳，等. 血管内膜增生模型的建立: 颈总动脉挤压法［J］.中国药理学通报，2001，17(6):708.
       
       ［6］梁爱群.川芎嗪的药理及机理研究［J］.时珍国医国药，2005，16（6），532.
       
       ［7］赵亚莉，张智国，刘洁，等. PKCζ与Raf在AngII引起的大鼠血管平滑肌细胞ERK1/2活化中的作用［J］.中国病理生理杂志，2007,23(1):35.
       
       ［8］Godeny MD, Sayeski PP. ANG II-induced cell proliferation is dually mediated by c-Src/Yes/Fyn-regulated ERK1/2 activation in the cytoplasm and PKCzeta-controlled ERK1/2 activity within the nucleus［J］.AM J Physiol Cell Physiol. 2006,291(6): 1297.
       
       ［9］冯津萍, 卢奕, 陈星，等. 川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖抑制作用的探讨［J］.中草药, 2007, 38（1）: 92.