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       【摘要】 
       目的考察冬凌草对细菌生长的抑制作用，并比较超临界提取产物与乙醇回流提取物的抑制效果。方法超临界二氧化碳萃取冬凌草，管碟法证明萃取产物的抑菌能力，并用二倍稀释法测定敏感菌的最小抑菌浓度(MIC)。结果冬凌草提取物在金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌生长平板上有很明显的抑菌圈，超临界提取物的最小抑菌浓度为（mg/ml）金黄色葡萄球菌0.031 75，藤黄八叠球菌0.015 875，枯草芽孢杆菌0.031 75，大肠杆菌0.125，产气杆菌0.125，绿脓杆菌0.062 5，变形杆菌0.062 5。结论冬凌草提取物对大多数的细菌生长有抑制作用，而且超临界提取物抑制效果明显优于乙醇回流提取物。
       【关键词】  冬凌草； 超临界二氧化碳萃取； 抑菌作用； 管碟法； 二倍稀释法； 最小抑菌浓度
       Antimicrobial Test of Extracts from Rabdosia rubescens
       LI Tong,YAN Yun, ZHAI Zengwei, FAN Limin, ZHOU Lili
       The School of Pharmaceutical Engineering,Shenyang Pharmacological University,Shenyang 110016, China
       Abstract:ObjectiveTo evaluate the bacteriostasis of extracts from Rabdosia rubescens. MethodsThe cylinder-plate method was used for improving the bacteriostasis of extracts from Rabdosia rubescens, while the double broth dilution method was used for determining minimal inhibitory concentration of sensitive bacteria. ResultsThe extracts of Rabdosia rubescens had certain inhibition zone on medium. The minimal inhibitory concentration of supercritical CO2 extracts was: Staphylococcus aureus,0.031 75;Sarcinalutea,0.015 875; Bacillus subtilis,0.031 75; Escherichia coli,0.125; Enterobacter aerogenes,0.125; Pseudomonas aeruginosa,0.062 5; Bacillus proteus,0.062 5 mg/ml.ConclusionThe extracts from Rabdosia rubescens are efective on most bacteria. The supercritical fluid extracts are better than the alcohol refluxing extracts.
       Key words:Rabdosia rubescens;  Supercritical CO2 Extraction;  Bacteriostasis;  Cylinder-plate method;  Double broth dilution method;  Minimal inhibitory concentr atio
        冬凌草Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara又名冰凌草，为唇形科香茶菜属多年生草本植物［1］。其中的冬凌草甲素是迄今为止研究最多，疗效最为明确的贝壳杉烯二萜类化合物［2］。药理学实验证明冬凌草甲素具有明显的抗癌、降压、抗菌、抗氧化等作用［3～5］。临床主要应用于治疗急性咽炎，扁桃体炎［6］等。近年来，超临界二氧化碳萃取技术由于其萃取能力强、萃取条件温和、绿色环保等优点，广泛应用于中药的提取分离［7］。本实验中冬凌草提取物由超临界二氧化碳提取法和传统的乙醇回流法获得。
        迄今为止，关于冬凌草的研究主要集中在抗癌、抗肿瘤药理作用以及提取工艺等方面，对其抗菌作用的相关报道较少。因此本文对不同提取工艺冬凌草提取物的抗菌范围进行了考察，并对其抗菌活性进行比较。
       1  材料
        实验菌种(沈阳药科大学微生物教研室提供：金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus  CMCC26001；枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis  SYCDC63501；绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa  SYCDC10104；藤黄八叠球菌 Sarcina lutea ATCC28001；大肠杆菌 Escherichia coli  ATCC25923；产气杆菌 Enterobacter aerogenes；变形杆菌 Bacillus proteus；克氏杆菌 Bacillus kerclmeri。
       2  方法
       2.1  不同提取工艺将河南省济源市药材供应站提供的冬凌草全草，叶和茎大致分开，取叶多茎少的部分粉碎，干燥至恒重，作为原料备用。
       2.1.1  乙醇提取工艺取干燥至恒重的冬凌草粗粉100 g,加400 ml 95%乙醇回流提取2次，2 h/次,先减压过滤滤去残渣，再常压过滤滤去絮状物，减压蒸馏回收溶剂后，真空干燥产物至恒重。经分析，所得浸膏中甲素含量为4.13%。
       2.1.2  超临界流体萃取工艺取干燥至恒重的冬凌草粗粉100 g，以萃取压力30 MPa，萃取温度50℃，夹带剂为95%乙醇，夹带剂量为150 ml，CO2流量4 L/h，提取时间3 h为超临界萃取条件，获得提取液。将提取液减压蒸馏挥干溶剂，真空干燥产物至恒重。经分析，所得浸膏中甲素含量为10.12%。
        将乙醇回流提取获得浸膏，作为供试品1号。将超临界萃取获得浸膏，作为供试品2号。以分析纯甲醇为供试品3号。
        取1号样品0.1 g溶于甲醇中，过滤，定容于100 ml容量瓶中，配成1 mg/ml的溶液，制得供试品4号。
        取2号样品，同方法制得供试品5号。
        取质量浓度为1 mg/ml的复方大青叶注射液（山东某制药有限公司），做为对照品6号。
        其中，1号，2号，3号供试药品，目的为确定冬凌草本身对细菌生长的抑制作用，消除溶剂干扰。
       2.2  菌悬液的制备从活化斜面上取各种试验菌分别接种于5 ml无菌液体肉汤培养基中，置37℃恒温培养箱内培养24 h。
       2.3  管碟法（cylinder-plate method）抑菌实验分别取试验菌悬液0.5 ml加到90 mm培养皿中，将融化态固体肉汤培养基20 ml倾倒至培养皿内，摇匀，制成混菌平板。每种菌各制备三皿，做好标记。待培养基凝固后，用无菌镊子取小钢杯在培养基表面。（每皿放置3个小钢杯）将3，4，5号供试药品各取0.25 ml分别滴入小钢杯中，取1、2号供试药品放在平板上。将培养皿盖换成陶土盖。37℃恒温培养24 h。
       2.4  最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration ,MIC）的测定用二倍稀释法(double broth dilution method)分别将4，5，6号供试药品配制成质量浓度为0.5,0.25,0.125,0.062 51,0.031 75,0.015 875 mg/ml，并另取一支不加药品的空白液体培养基作为对照样品。取1∶100试验菌液0.1 ml加入各试管中，摇匀，37℃培养24 h后观察结果。对照管长菌已混浊，这时能完全抑制试验菌生长的最高稀释倍数管即为最小抑菌浓度。
       3  结果与讨论
       3.1  管碟法实验结果数据见表1。表1  管碟法实验结果（略）
        “+”表示有菌生长，即实验样品对菌体无抑制效果；“-”表示无菌生长，即实验品对菌体生长有抑制效果
        由表1可见，冬凌草对除克氏杆菌外的革兰氏阳性阴性菌，均有明显的生长抑制作用。
       3.2  二倍稀释法实验结果数据见表2。表2  二倍稀释法实验结果（略）
       “+”表示有菌生长，即实验样品对菌体无抑制效果；“-”表示无菌生长，即实验品对菌体生长有抑制效果    MIC数据见表3。表3  MIC实验结果（略）
        由表3中的MIC可见，冬凌草提取物对藤黄八叠球菌生长抑制效果最好，对其它敏感菌的抑制作用要优于复方大青叶注射液。并且超临界萃取提取物比乙醇回流提取物的抑菌活性更好。
       3.3  讨论实验首先通过分析乙醇回流提取的冬凌草浸膏（1号供试药品）和超临界二氧化碳提取的冬凌草浸膏（2号供试药品），确定了冬凌草提取物对除克氏杆菌外的敏感菌生长有抑制作用。甲醇（3号供试药品）在混菌平板上无抑菌圈，表明溶剂对菌体生长没有影响。乙醇回流提取物的饱和甲醇溶液（4号供试品）和超临界二氧化碳提取物的饱和甲醇溶液（5号供试品）的结果与1号，2号供试药品一致，说明甲醇与药品混合后对药品的抑菌作用无影响，所以选用甲醇作为溶剂方法可行，结果可靠。
        管碟法实验证明了冬凌草对除克氏杆菌外，金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌这些革兰氏阳性菌及大肠杆菌、产气杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌这些革兰氏阴性菌的生长均有抑制能力。
        敏感菌的MIC结果显示，冬凌草的抑菌效果好于复方大青叶注射液。由于超临界提取物中甲素含量远高于乙醇回流提取物，冬凌草甲素为冬凌草主要抗菌成分，所以超临界萃取产物的抑菌效果优于乙醇回流提取物。
       4  结论
        超临界二氧化碳萃取法与传统的乙醇回流提取法相比，操作简单，条件温和，无溶剂残留，甲素含量高，抑菌作用更为明显。
        与复方大青叶注射液相比，冬凌草对典型的临床致病菌的生长抑制作用更好,可以考虑临床应用。
       【参考文献】
         　［1］王绍丰,卢啟立.冬凌草的现代研究概况［J］.广州医药,2008,39(1):46.
       
       ［2］李 钦,冯卫生.冬凌草化学成分药理作用及开发研究进展［J］.河南中医学院学报,2003,18(6):31.
       
       ［3］左海军,李丹，吴斌，等.冬凌草的化学成分及其抗肿瘤活性［J］.沈阳药科大学学报,2005,22(4):258.
       
       ［4］冉 倩,徐静宜，吴晓明，等.冬凌草甲素的研究进展［J］.药学与临床研究,2007,15(2):92.
       
       ［5］许 霞,张小莉，闫素清，等.冬凌草甲素等二萜类化合物的抗氧化作用［J］.海峡药学,2002,14(6):28.
       
       ［6］冯子彦,张福兰,田效杰.复方冬凌草含片治疗急性咽炎、扁桃体炎的疗效观察［J］.右江医学,2006,34(6):599.
       
       ［7］王志祥,刘亚娟,刘芸.超临界流体萃取技术及其在中药开发中的应用［J］.时珍国医国药,2006,17(4):651.