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       【摘要】 
       目的研究碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长及其内迷迭香酸积累的影响。方法改变培养基中蔗糖浓度和碳源种类，考察不同碳源及其浓度对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响。在总氮源不变的情况下改变NO3-/NH4+的比例，考察不同NO3-/NH4+比例对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响。结果蔗糖是冬凌草愈伤组织培养中的最佳的碳源，其浓度为3%时，有利于冬凌草愈伤组织的生长和迷迭香酸的积累;NO3-/NH4+比例为1∶1时，愈伤增值倍数最高；NO3-/NH4+比例2∶1时，迷迭香酸的积累量最大。结论实验确定了冬凌草愈伤组织培养的最佳碳源种类、浓度及氮源比例,表明不同碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长和次生代谢物合成有显著影响。
       【关键词】  冬凌草； 愈伤组织； 碳源； 氮源； 迷迭香酸
       Effects of Carbon，Nitrogen Sources on Growth and Rosmarinic Acid Accumulation of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara Callus
       LI Hanwei,SU Xiuhong，DONG Chengming*，WANG Weili
       （He’nan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effects of carbon, nitrogen on growth and rosmarinic acid accumulation of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara callus.MethodsThe callus growth and rosmarinic acid accumulation were studied by manipulation of concentration sucrose, carbon and nitrogen. ResultsSucrose was the best for the callus growth and rosmarinic acid accumulation. 30 g/L sucrose was favorable for callus multiplication and rosmarinic acid accumulated. The maximum callus multiplication, content of accumulated rosmarinic acid  were achieved while the ratio of NO3- and NH4+was 1∶1， 2∶1，respectively when concentration of total nitrogen source was kept at the same level. ConclusionVarious carbon, nitrogen have significant effects on growth and rosmarinic acid accumulation of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara callus. The best carbon source and its concentration,nitrogen sources for the growth of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara callus and the synthesis of secondary metabolite were confirmed.
       Key words： Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara;  callus;  Carbon; Nitrogen;  Rosmarinic acid
       
       冬凌草Rabdosia rubescens (Henmsl.)Hara为唇形科香茶菜属多年生植物,其入药部位是地上部分。近年来许多学者对冬凌草化学成分、药理作用及临床疗效进行了研究，发现其中的主要抗癌、抗菌活性成分为二萜类化合物（冬凌草甲素、冬凌草乙素）和多酚类化合物迷迭香酸，并对其作了较深入的研究［1,2］。国内学者在冬凌草组织培养方面也开展了相关工作［3～5］，但均不够系统和完善，且未对影响其愈伤培养物生长及其内次生代谢产物积累的因素进行研究。迷迭香酸作为冬凌草水溶性部分中主要的有效成分，具有较好的抗菌、消炎、止痛的功效,为此，笔者在本实验室对冬凌草离体培养研究的基础上［6,7］，对影响其愈伤组织生长和代谢产物积累的碳、氮源种类及蔗糖浓度进行了研究，并考察了这些因素对其内主要次生代谢产物－迷迭香酸和冬凌草甲素的影响(因在整个愈伤组织培养过程中未检测到冬凌草甲素,故其积累规律在文中未进行探讨)，为进一步提高冬凌草培养物内有效成分产量、优化培养条件提供依据。
       1  材料与方法
       1.1  愈伤组织的获得 
       以冬凌草叶片作为外植体，在MS附加6-BA 2.0 mg/L，NAA 1.0 mg/L的培养基上诱导愈伤组织，将诱导出的愈伤组织在上述培养基上，经过3～4代的培养，形成质地较为均匀的愈伤组织。
       1.2  蔗糖浓度处理 
       将继代培养获得的愈伤组织接种到蔗糖浓度为1%，2%，3%，4%，5%的愈伤生长培养基上，每瓶4～6块愈伤组织，每个处理重复8次，并称取接种时的接种量，培养25d后，统计不同蔗糖浓度下愈伤组织的收获量，培养过程中观察愈伤组织的的生长情况。
       1.3  碳源处理 
       分别以蔗糖、葡萄糖、果糖为碳源，浓度为3％。将继代培养获得的愈伤组织接种于附加6-BA 2.0 mg/L，NAA 1.0 mg/L的MS培养基，每瓶4～6块愈伤组织，每个处理重复8次，并称取接种时的接种量，培养25 d后，称重不同碳源下愈伤组织的收获量，计算愈伤组织的增殖倍数，培养过程中观察愈伤组织在不同碳源上的生长情况。
       1.4  氮源处理 
       在总氮量不变的情况下，将继代培养获得的愈伤组织接种到改变NO3-/NH4+比例的MS培养基上。每瓶接种4～6块愈伤组织，每个处理重复8次，并称取接种时的接种量，培养25 d后，统计不同氮源下愈伤组织的收获量，培养过程中观察愈伤组织的生长情况。
       1.5  迷迭香酸含量的测定
       1.5.1  样品的处理将各个处理的冬凌草愈伤组织，置于烘箱中，80℃烘至恒重，用研钵研成粉末。精密称定粉末0.25 g，置于50 ml的三角瓶中，每次加甲醇20 ml，超声提取30 min，提取两次，合并滤液，回收溶剂，用甲醇溶解残渣，定容于5 ml的容量瓶中，用0.45     μm微孔滤膜过滤，备用。
       1.5.2  色谱条件 
       日本岛津LC-20A，色谱柱：ODS柱C18（4.6 mm×250 mm），流动相：甲醇-0.5%磷酸水溶液（40∶60），检测波长：335 nm，流速：1.0 ml/min，柱温：25℃。迷迭香酸为Y= 2 447 526.68X－7 443 410.80，r=0.999，迷迭香酸进样量2.55～8.925μg时，线性良好。
       2  结果
       2.1  不同蔗糖浓度对冬凌草愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响冬凌草愈伤组织在不同蔗糖浓度上的生长情况见表1。由表1可知，随着蔗糖浓度的增加，愈伤组织的颜色由淡黄绿色变为深绿色，质地由疏松状态逐渐变得较为致密，愈伤增殖倍数也逐渐增加，但当蔗糖浓度为5％时，其增殖倍数有又所降低。从愈伤生长及其增殖来看，以3％、4％蔗糖浓度培养愈伤时其生长情况较好，此时愈伤组织质地较为致密，颜色为翠绿色且未见褐化现象或褐化率较低，愈伤增殖倍数较高，分别为1.58，1.69倍。而从迷迭香酸的积累来看，5％的蔗糖浓度最有利于迷迭香酸的合成，此时其含量最高，为1.52％，其次为3%的蔗糖浓度。2％蔗糖浓度最不利于迷迭香酸的积累，此时其含量最低，为0.68％。综合经济成本、愈伤生长情况、迷迭香酸积累来看，冬凌草愈伤组织培养时以3%的蔗糖浓度为最佳。表1  不同蔗糖浓度对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响（略）
       2.2  不同碳源对冬凌草愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响 
       分别以蔗糖、葡萄糖及果糖作为碳源培养冬凌草愈伤组织，发现碳源种类对其生长情况有明显的影响。结果见表2。从表2中可以看出，以蔗糖作为碳源时愈伤组织颜色为翠绿色，质地最为致密，没有褐化现象且愈伤组织的增殖倍数最大，为14.5倍。迷迭香酸的含量为1.41%。以葡萄糖作为碳源时愈伤组织颜色为黄绿色，质地比较致密，培养过程中愈伤组织表面出现褐化斑点，愈伤褐化率为0.10%，愈伤组织的增殖倍数为8.72，迷迭香酸的含量最低，为1.06%，当以果糖作为碳源时愈伤组织颜色为淡黄白色，质地比较疏松，培养过程中愈伤组织褐化比较严重，褐化率为57.34%。其愈伤组织增殖倍数也最低，仅为7.2倍。但此时迷迭香酸的含量最高，为1.54%。但综合愈伤生长、增殖倍数及迷迭香酸含量来看，蔗糖是冬凌草愈伤组织培养时的最佳碳源。表2  不同碳源对愈伤组织生长及迷迭香酸积累的影响（略）
       2.3  不同氮源对愈伤组织生长和迷迭香酸积累影响培养基中NO3-/NH4+的比例对冬凌草愈伤组织的生长有很大的影响，由表3可知，当以NO3-作为唯一氮源时，愈伤组织颜色为黄绿色，质地致密，且仅顶端有少量的褐化斑点，褐化率为4.5%，随着NH4+的加入（NO3-/NH4+为3∶1），愈伤颜色变为淡绿色，质地较致密，但褐化斑点几乎遍布整个愈伤组织，褐化率达到了42.62%。当NO3-/NH4+进一步降低为2∶1时，愈伤颜色为淡黄绿色，质地致密，仅顶端偶见褐化斑点，褐化率为0.05%，当NO3-/NH4+为1∶1时，颜色变为黄褐色，质地很疏松，愈伤基本全部褐化，褐化率为100％。从愈伤组织的增殖倍数来看，NO3-/NH4+为3∶1时，愈伤增殖倍数最低，为10.37倍。NO3-/NH4+为1∶1时，愈伤增殖倍数最高，为16.92倍，但该配比下愈伤严重褐化。其次为NO3-/NH4+2∶1时。从次生代谢物的积累来看，当以NO3-作为唯一氮源和NO3-/NH4+为2∶1时，有利于迷迭香酸的积累，其他处理下的含量均较低。综合生长情况、愈伤增殖及迷迭香酸的合成来看，NO3-/NH4+为2∶1时是最佳培养基。表3  氮源对愈伤组织生长及迷迭香酸积累的影响（略）
       3  讨论
          
       糖是培养基中不可缺少的碳源，在植物组织培养时主要起到提供物质能量和维持渗透压的作用。其种类和浓度对培养物的生长和次生代谢产物的积累起着主要的作用。在植物组织培养中通常采用蔗糖、葡萄糖。尽管有些研究表明葡萄糖对植物细胞的生长和次生代谢产物的积累有利，但多数实验证明组织培养时，以采用蔗糖作为碳源最好。本研究也表明综合冬凌草愈伤组织的生长和次生代谢物的积累来看，以蔗糖作为碳源是最为有利。并且发现蔗糖浓度的高低对愈伤生长及代谢产物的积累有着明显的影响。从1%～4%，愈伤增殖倍数随蔗糖浓度增加而增加，蔗糖浓度为3％时，无褐化现象，且增殖略低于4％。4％时，虽愈伤增殖倍数最高，但有褐化现象，但当蔗糖浓度进一步增加时（5%），愈伤增殖倍数反而降低，这可能与蔗糖浓度过高，培养基的渗透压大，不利于愈伤生长有关。高浓度的蔗糖浓度虽然抑制了愈伤组织的生长但有利于次生代谢产物的积累，本研究表明，迷迭香酸含量在蔗糖浓度达到5%时，达到最高。说明适当提高渗透压有利于迷迭香酸的合成,这一点与前人对唇形科植物彩色紫苏、紫草科植物紫草的细胞相一致 ［8］。但综合经济成本、愈伤生长及迷迭香酸的积累来看，认为冬凌草愈伤培养时采用3%蔗糖浓度最佳。
       
       氮源在培养基的表现形式主要是氨态氮和硝态氮，有关氮源对有效成分的积累影响报道很多。如在长春花细胞培养的研究中发现，氮源的加入可以促进细胞的生长，在雷公藤培养中，增加KNO3的浓度有利于细胞内二萜内酯的积累。氨态氮和硝态氮的比例对植物愈伤组织的培养和细胞培养过程中生物量和有效成分的积累起着关键的调节作用。郭肖红等［9］在丹参不定根的培养中，发现氨态氮和硝态氮的比例为1∶4时，其不定根增殖倍数达到最大值,而且次生代谢物的量明显增加。本研究表明硝态氮和氨态氮比例为1∶1时,愈伤组织增殖率虽然最高，但愈伤褐化现象较为严重，且次生代谢产物的合成受到抑制,表现在迷迭香酸的含量最低。总的看来,氮源对冬凌草愈伤组织的生长和次生代谢物积累以硝态氮和氨态氮的比例为2∶1时最佳。
       【参考文献】
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       ［9］郭肖红，高文远，李克峰. 丹参不定根组织培养的研究(Ⅱ)碳源、氮源和磷源对丹参不定根培养的影响［J］.中草药， 2007，38 (6):907.