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       【摘要】 
       目的观察大黄虫丸各功效组分对大鼠实验性肝纤维化的作用。方法建立肝纤维化大鼠模型。全自动生化分析仪测定ALT、AST、TP、ALB，放免法测定HA、LN、 CⅣ、PCⅢ，光镜下观察肝组织形态学及胶原纤维增生情况。结果各功效组分均能一定程度上改善肝功能及降低肝纤维化血清指标（P <0.01或P <0.05），光镜下可见各药物组肝纤维化程度与模型组相比差异显著（P<0.05）。其中活血化淤组在降低ALT、AST及肝纤维血清指标方面效果较好，而滋阴养血组能更有效地升高TP及ALB。结论大黄虫丸各功效组分均有一定的抗肝纤维化作用，其中活血化淤组作用更为明显。
       【关键词】  肝纤维化； 大黄虫丸； 肝功能； 病理
       Effects of Divided Function of Dahuang Zhechong Pill on Experimental Hepatic Fibrosis in Rats
       LAI Jingshao,CAI Hongbing,CHEN Wenqian，LIU Qiang,CHEN Yuyao,LV Zhiping
       College of Traditional Chinese Medicine , Southern Medical University , Guangzhou 510515，China
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of divided function of Dahuang Zhechong Pill (DR-DZP) on experimental hepatic fibrosis in rats. MethodsIn rats with experimental hepatic fibrosis, automatic biochemical analyzer was used to detect ALT,AST,TP,Alb, radioimmunoassay was used to detect HA,LN,CⅣ,PCⅢ,and pathological changes under a light microscope were observed.ResultsCompared with the model control, all the DR-DZP could improve the liver function,reduce serum markers of liver fibrosis(P<0.01 or P<0.05),and evidently lower the pathological level of liver fibrosis(P<0.05).The group of Huoxuehuayu was better in lowering ALT, AST and serum markers of liver fiber,and the group of Ziyinyangxue was more effective in elevating TP and ALB. ConclusionAll the DR-DZP can improve the liver function and reduce serum markers of liver fibrosis, among them, Huexuehuayu group is more effective.
       Key words：Hepatic Fibrosis;   Dahuang Zhechong Pill;   Liver function;   Pathology
        肝纤维化(Hepatic fibrosis，HF)是指肝脏内细胞外基质(ECM)的合成大于降解，导致纤维结缔组织异常过度沉积。肝纤维化是肝硬化形成的早期阶段和必经阶段，也是唯一在一定情况下可被逆转的阶段。如病因持续存在，肝纤维化逐渐加重，肝小叶及血管等逐渐被改建，肝脏的正常结构遭到破坏，中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成，即发展为不可逆转的肝硬化［1］。
        大黄虫丸出自张仲景所著《金匮要略》，由大黄、虫、水蛭、虻虫、蛴螬、桃仁、干漆、生地黄、芍药、黄芩、杏仁、甘草12味药材组成，具有疏通经络、破淤生新、缓中补虚、清热润燥、滋阴养血之功效，是祛淤生新的代表方剂，攻补兼施，主治五劳虚极，淤血内停之干血劳；动物实验及临床观察表明大黄虫丸对各种原因引起的肝纤维化均有良好的治疗作用［2～6］。本研究的目的是在全方有效的基础上，按照大黄虫丸的功效组成进行拆方研究，进一步探讨大黄虫丸抗肝纤维化有效的功效组分，为深入研究其组方规律及作用机制奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康Wistar大鼠58只，雄性，体质量180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号:SCXK粤2006-0015)。
       1.2  试剂二甲基亚硝胺（DMN），购自天津化学试剂研究所，批号060523。
       1.3  药物大黄虫丸按功效将全方诸药拆分为3部分，分别为：活血化淤组，由水蛭60 g，虫30 g，虻虫45 g，蛴螬45 g，桃仁120 g，干漆30 g组成；清热润燥组，由大黄300 g，黄芩60 g，杏仁120 g组成；滋阴养血组，由生地黄300 g，芍药120 g，甘草90 g组成［7］。12味中药药材由南方医科大学中药制剂教研室提供，将12味中药分别制成超微粉剂，临用前按照全方的剂量比配制成混悬液使用。
       1.4  仪器AU5400全自动生化分析仪（日本HITACHI公司）；普通光学显微镜（日本Olympus公司）；超薄石蜡切片机（瑞典LKB公司)。
       2  方法
       2.1  分组、模型制备及药物干预58只大鼠随机分为6组：正常组、模型组、大黄虫丸全方组、活血化淤组、清热润燥组、滋阴养血组，正常组8只，其余每组10只。用生理盐水将DMN稀释为0.5%DMN溶液（体积比），模型组及各药物组大鼠以10 mg/(kg·d)0.5%DMN溶液腹腔注射，每周连续3 d，共4周［8］。造模的第1天开始灌胃给药（正常组与模型组除外），大黄虫丸全方组每日给药剂量为4.4 g/kg、活血化淤组1.1 g/kg、清热润燥组1.6 g/kg、滋阴养血组1.7 g/kg（根据动物与人体表面积比值推算出动物的给药剂量），连续灌胃28 d。在整个实验过程中，以普通饲料喂养大鼠，自由饮用自来水。
       2.2  指标检测实验期满后，动物禁食不禁水12 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉采血，真空负压采血管收集，室温静置1.5 h，2 500 r/min离心15 min，取上层血清，分装于离心管中，用AU5400全自动生化分析仪测定血清谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)，试剂盒为南京建成生物工程公司产品；放免法测定血清透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、Ⅲ前胶原(PCⅢ)，试剂盒来自上海海研生物医学技术有限公司（均按试剂说明书进行）。
       2.3  病理学观察大鼠予10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰卧位固定，打开腹腔，取1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小肝组织，40 g/L中性甲醛液固定，24 h后逐级酒精脱水，二甲苯透明，56℃石蜡包埋，4 μm厚切片，制成切片分别用于进行苏木素-伊红（HE）及Mallory染色，光镜下观察肝组织形态学及胶原纤维增生情况。肝纤维化程度分级参考［9］：0级，肝组织正常，无胶原纤维增生；Ⅰ级，胶原纤维在汇管区或中央静脉周围轻度增多；Ⅱ级，中央静脉区胶原纤维间隔形成；Ⅲ级，中央静脉到中央静脉或中央静脉到汇管区纤维间隔形成或相连接；Ⅳ级，多数纤维间隔形成，分隔肝实质并形成假小叶，假小叶中央时见汇管区。
       2.4  统计学分析利用SPSS13.0统计软件，对计量资料采用单向方差分析（one-way ANOVA），先对数据进行方差齐性检验，并分别用LSD或Games-Howell法进行组间比较， 结果以±s表示；对等级资料采用非参数组间秩和检验。
       3  结果
       3.1  一般状况和形态学观察实验过程中，正常组大鼠生长状态良好，皮毛光滑，二便如常；模型组大鼠活动少，喜睡少动，皮毛欠光滑，尿色黄；各药物组大鼠状态较正常组稍差，但比模型组明显改善。全部实验结束后，正常组大鼠无死亡，模型组及滋阴养血组丸组大鼠各死亡3只，大黄虫丸全方组、活血化淤组及清热润燥组大鼠各死亡2只，死亡多在造模第4周后发生。各药物干预组间死亡率无明显差异。
       3.2  血清ALT、AST、TP、ALB的变化与正常组比较，模型组ALT、AST的含量显著升高(P<0.01)，TP、ALB含量显著降低(P<0.05)；中药干预后，与模型组相比，大黄虫丸全方及各功效组分用药组ALT和AST的含量均有不同程度下降，其中全方组及活血化淤组ALT、AST含量下降更为明显 (P<0.01)；与模型组相比，大黄虫丸全方及各功效组分均能不同程度升高TP、ALB含量，其中各组均显著升高TP含量(P <0.05)，而滋阴养血组TP、ALB升高最为明显(P<0.01)。结果见表1。表1   不同药物组对肝纤维化大鼠肝功能的影响（略）
       3.3  肝纤维化指标(血清中HA，LN，CIV，PCⅢ)的变化   
       与正常组相比，模型组动物血清中的HA，LN，CIV，PCⅢ显著升高(P <0.01)；与模型组相比，大黄虫丸全方及各分组的HA，LN，CIV，PCⅢ均有所下降，其中大黄虫丸全方及活血化瘀组的HA，LN，PCⅢ，CIV下降更为明显，与模型组差异更大（P <0.01)，而清热润燥组及滋阴养血组HA、CIV显著下降（P <0.05），但对LN，PCⅢ的影响不明显(P >0.05)。结果见表2。表2  不同药物组对肝纤维化大鼠肝纤维化指标的影响（略）
       3.4  各组大鼠肝脏病理组织学结果结果见表3。正常组大鼠肝小叶结构完整，无炎细胞浸润及胶原纤维增生；模型组大鼠肝纤维化程度较明显，肝小叶结构不完善，肝细胞片状坏死、炎性细胞浸润严重，有胶原纤维构成的纤维间隔，形成假小叶。清热润燥组及滋阴养血组汇管区仍有不同程度的纤维增生、炎性细胞浸润，少数大鼠仍有不完全性假小叶形成，但较模型组轻；而大黄虫丸全方及活血化淤组仅可见少量肝组织炎症细胞浸润，肝细胞坏死少见，纤维增生不明显，与模型组相比，肝纤维化程度减轻更为明显。表3  各组肝纤维化程度比较例（略）
       4  讨论
        肝纤维化是向肝硬化发展的过渡阶段，是危害人类健康的常见病和多发病，中药复方治疗是祖国医学的特点所在，中医药抗肝纤维化的作用日益受到人们的重视［10］，而有关中药复方组方规律的现代化研究更是一个热点课题。
        祖国医学把肝纤维化归属于“癥积”“胁痛”“黄疸”等范畴，认为其病因病机初期多因湿热毒邪侵害肝胆，湿热困阻中焦，久而形成血淤，为淤血内阻肝经，加之久病人体正气渐虚，形成虚实夹杂的复杂证候。大黄虫丸是著名的经方，在临床上应用广泛，本方并非单纯一活血化淤方，既有破血逐淤之虫类药，又伍以滋阴养血及清热润燥之品。因而，本方为攻补兼施、缓中补虚的典型方剂，其整方抗肝纤维化的疗效确切，但有关大黄虫丸功效组分的拆方研究报道甚少，本实验为研究大黄虫丸抗肝纤维化的主要功效成分及组方规律，分别以全方及各功效组分干预DMN诱导的肝纤维化模型大鼠来观察药物作用。
        DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性，造模4周即有明显肝纤维化表现，具有造模周期短、肝纤维化形成相对稳定的特点，所致病变类似人类肝病病理改变，且长期稳定存在，较适宜进行肝纤维化的研究。这次实验通过腹腔注射DMN制备大鼠肝纤维化模型，在大黄虫丸全方有效的基础上按功效组分进行拆方研究，探讨其组方规律。结果显示，与正常组大鼠比较，模型组大鼠肝功能及肝纤维化各项血清指标明显异常，且病理组织显示模型组大鼠肝纤维化程度明显，表明用DMN诱导肝纤维化大鼠模型存在明显肝损伤及肝纤维化病变；大黄虫丸拆方各功效组分对实验性肝纤维化大鼠有不同程度改善肝功能、降低肝纤维化各项指标的作用，其中全方组及活血化淤组在降低ALT、AST及肝纤维化血清指标（HA、LN、CIV、PCⅢ）方面效果最为明显，而滋阴养血组有明显的升高总蛋白和白蛋白的作用；病理组织观察显示大黄虫丸全方及各功效组分均可以不同程度减轻肝内炎细胞浸润程度，减少肝脏胶原纤维增生，从而达到降低肝纤维程度的目的，尤其以全方组及活血化淤组效果最为明显。表明大黄虫丸全方及各功效组分能抑制胶原过度增生沉积，具有良好的抗肝纤维化大鼠模型肝损伤及肝纤维化的作用。
        综上所述，肝纤维化病机不外乎“热毒、血淤、体虚”，前期热毒侵犯，日久则正气渐虚，但其病变主要阶段仍在于淤血内阻；而大黄虫丸从方剂组成药物中可以看出，主要由活血、清热、补虚三部分药物组成，既有桃仁及各虫类药物活血化淤散结，又合大黄、黄芩、杏仁清解郁热，加上地黄、芍药、甘草滋阴养血濡脉，诸药合用可起到活血化淤为主兼有补虚及清热解毒之功。本次实验结果亦表明，大黄虫丸全方及各功效组分通过保护肝功能及抑制肝脏纤维组织形成，有一定的抗肝纤维化作用，其中以整方作用最为明显，而各功效组分中活血化淤组效果更佳，这可能与其疏通经络、活血化淤功效有关，但其确切作用机制有待进一步研究。　
       【参考文献】
         　［1］Xiao JC, Jin XL, Ruck p, et al. Hepatic progenitor cells in human liver cirrhosis: immunohistochemical, electron microscopic and immunofluorencence confocal.microscopic findings［J］. World J Gastroenterol，2004，10(8):1208.
       
       ［2］Chen Xiaoyin, Li Enqing, Yang Qinhe, et al. Clinical study of Dahuang Zhechong Pill in treating posthepatitis B hepatic fibrosis［J］. CJIM，2004，10（1）:63.
       
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       ［6］伍竹君，王邦才. 中医药调节肝纤维化相关因子的研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2007，6： 784.
       
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       ［10］刘成海.中医药抗肝纤维化临床与基础研究进展［J］. 世界科学技术-中医药现代化，2007，2：112.