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       【摘要】 
       目的探讨大黄虫丸防治肺纤维化作用及机理。方法用平阳霉素诱导肺纤维化模型大鼠后，用药组每天灌胃大黄虫丸，分别于第7天，14天后处死各组大鼠，观察、比较各组大鼠肺部病理组织学改变及肺泡灌洗液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)表达。结果第14天模型对照组出现一定程度的肺纤维化，模型对照组肺纤维化程度显著重于正常对照组（P<0.05），大黄虫丸组肺纤维化程度显著低于模型对照组（P<0.05）；第7天、第14天模型对照组SOD活性显著低于正常对照组（P<0.05）；大黄虫丸组与模型对照组相比无显著差异（P>0.05）。第7天模型对照组LPO活性与正常对照组相比无显著差异（P>0.05）；第14天模型对照组LPO显著高于正常对照组（P<0.05）；大黄虫丸组显著低于模型对照组（P<0.05）。结论大黄虫丸能明显减轻平阳霉素所致的大鼠纤维化程度，并能显著降低LPO的表达。
       【关键词】  肺纤维化； 超氧化物歧化酶； 脂质过氧化物； 大黄虫丸； 大鼠
       Effect of Dahuangzhechong on Superoxide Dismutase and Lipid Hydroperoxide Bronchoalveolar Lavage Fluid in Lungs from Bleomycin A5-induced Pulmonary Fibrosis in Rats
       LI Ruiqin, LI Wei,SONG Jianping*, ZHANG Rui, ZHANG Xianwei
       Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450008,China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Dahuangzhechong (DHZC) on pulmonary fibrosis.MethodsPulmonary fibrosis was induced by bleomycin A5 in SD rats. Rats in drug group were killed after taking DHZC daily for 7 and 14 days. The lungs of all rats were harvested for histopathological study. The contents of Superoxide Dismutase(SOD)and lipid hydroperoxide (LPO) in bronchoalveolar lavage fluid were measured and compared. ResultsThe degree of the pulmonary fibrosis in bronchoalveolar lavage fluid was increased significantly in model group as compared with the normal group and content DHZC treated group(P<0. 05) . The activity of SOD in model group was lower than that in normal group on the 7th day and 14th day (P<0.05), and there was no significant difference between model group and DHZC treated group(P>0. 05); the content of LPO in model group was higher than that in normal group on the 14th day (P<0.05), and the content of LPO in DHZC treat group was lower than that of model group(P<0.05).ConclusionDHZC can significantly decrease the content of LPO and alleviate the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis induced by bleomycin A5 in SD rats.
       Key words： Pulmonary fibrosis;  Superoxide Dismutase(SOD);  Lipid hydroperoxide (LPO);  Dahuangzhechong (DHZC);   Rat
        肺间质纤维化是多种肺间质疾病发展到晚期的一种常见病理变化。虽然导致肺纤维化的原因不同,但其病理变化都从肺泡炎开始。一般认为肺纤维化改变是不可逆的, 西医治疗肺纤维化首选糖皮质激素，但只有部分如非特异性间质性肺炎（NSIP）和脱屑性间质性肺炎（DIP）等对激素反应较好，另一方面长期大剂量应用激素必将引起严重的代谢紊乱、免疫抑制和继发感染等不良反应。本实验在有关文献和既往课题研究的基础上, 研究大黄虫丸对肺纤维化疾病模型早期的肺部病理损害和肺泡灌洗液中超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)的影响, 对肺纤维化的发病机制和大黄虫丸对肺纤维化的干预机制进行探讨，为肺纤维化的中医药防治研究提供参考依据。
       1  材料
       1.1  动物普通级健康Wistar大鼠42只，雌性，体质量180～220 g，由河南省动物实验中心提供，动物批号：0001432。饲养于河南中医学院动物实验中心，室温（22±2）℃，相对湿度60%，常规饲料喂养，饮水量不限。
       1.2  主要药物、试剂与仪器平阳霉素，天津太河制药有限公司产品,批号PBW04080201。大黄虫丸，湖南九芝堂制药厂产品，批号041005，每包3 g。超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，南京建成生物工程研究所产品，批号：041022。脂质过氧化物(LPO)测试盒，南京建成生物工程研究所产品，批号：041016。
       2  方法
       2.1  动物分组将动物随机分为3组：正常对照组、模型对照组、大黄虫丸组，各组动物均为14只。
       2.2  动物造模与用药本实验选用大鼠气管内一次性注入平阳霉素复制肺纤维化模型［1］。除正常对照组正常饲养不作任何处理外，模型对照组及用药组按文献方法造模。从造模后第2天开始，用药组分别灌胃药液1.5 ml/100 g体质量，模型对照组灌入等量生理盐水。给药1次/d，每周复查动物体质量以调整给药量，各组于用药第7天、14天分别处死一半动物。造模用药平阳霉素按3 mg/kg进行给药,使用时用生理盐水配制成2 mg/ml,按0.15 ml /100 g气管内给药。其他药物根据临床常用药量,参照动物与人体表面积折算系数计算动物每天用药量，大黄虫丸按1.2 g/kg体质量进行给药。使用时用生理盐水配制成80 mg/ml，按1.5 ml /100 g体质量灌胃给药。
       2.3  指标观察
       2.3.1  观察实验动物一般情况体质量、饮食、皮毛、活动状况等。
       2.3.2  肺脏形态学观察实验结束时称取动物体质量,腹主动脉取血处死动物,完整摘取肺脏,肉眼观察脏器病变情况。
       2.3.3  肺脏病理组织学检查取右肺下叶固定、脱水、包埋、切片,分别进行HE、VG染色。参照文献［2］将肺泡炎或肺纤维化程度分级: 0级无肺泡炎或无纤维化(-);Ⅰ级:轻度肺泡炎或纤维化(+),受累面积少于20%;Ⅱ级:中度肺泡炎或纤维化(++),受累面积20%～50%;Ⅲ级:重度肺泡炎或纤维化(+++),受累面积>50%。
       2.3.4  肺泡灌洗液脂质过氧化物(LPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的检测分离右肺后结扎右侧支气管，用磨钝的9号腰穿针头进入左主支气管内，将左肺放入盛有冰生理盐水的烧杯中，用37℃无菌生理盐水进行灌洗，每次灌入2 ml，并反复抽洗4次，至洗出液总量约6 ml为止，平均回收率为75.65％±0.8％。全部灌洗液混合后备用，检测前摇匀。按照LPO，SOD试剂盒说明检测回收液中LPO、SOD。
       2.4  统计学处理数据采用SPSS 13.0统计软件处理，对服从正态分布的组间计量资料数据以±s表示，对不服从正态分布的计量资料采用中位数±四分位数间距进行统计描述。肺纤维化程度为等级计数资料，采用Radit分析，以R值表示，组间R值的显著性检验采用t检验。
       3  结果
       3.1  一般情况正常对照组大鼠皮毛光滑，身体健壮，反应灵敏，饮食、活动、体质量增长正常；模型对照组皮毛干枯稀疏，精神不振，反应迟钝，进食、排便、活动均减少；大黄虫丸组动物皮毛有光泽，身体较壮，反应尚可，饮食、活动较正常，体质量稍有所增加。
       3.2  肺组织病理学检查
       3.2.1  肺整体形态观察第7天正常对照组肺外观无明显异常，呈粉红色，表面光滑；模型对照组、大黄虫丸组两肺肿大，呈暗红色，表面可见散在出血点。第14天正常对照组肺外观无明显异常，呈粉红色，表面光滑；模型对照组、大黄虫丸组两肺呈暗红色，弹性降低，表面可见小片状灰白色斑块。
       3.2.2  肺组织光镜下病理检查正常对照组肺组织结构正常，肺泡壁小叶间隔无增宽，间质无炎性细胞浸润和纤维组织增生。第7天模型对照组部分肺泡腔缩小或萎陷、肺泡壁小叶间隔明显增宽、以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润，多呈现2～3级的肺泡炎改变，未见明显肺纤维化改变，而到第14天肺间质有少量胶原，肺泡炎病变减轻，呈现1级纤维化和1～2级肺泡炎改变。
        统计结果显示：模型对照组第7，14天肺泡炎程度显著高于正常对照组(P<0.05)，第14天模型对照组出现轻度肺纤维化表明动物模型复制成功；大黄虫丸组肺泡炎Ridit值低于模型对照组 (见表1)，模型对照组肺纤维化Ridit值显著高于正常对照组（P<0.05）；大黄虫丸组肺纤维化Ridit值显著低于模型对照组（P<0.05）(见表2)。提示大黄虫丸有减轻平阳霉素所致大鼠肺泡炎和肺纤维化病变的作用。各组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度分级结果比较见表1～2。表1  模型第7天、第14天各组肺泡炎程度比较(略)表2  模型第7天、第14天各组肺纤维化程度比较(略)
       3.3  肺泡灌洗液SOD活性和LPO活性比较第7天、第14天模型对照组SOD活性显著低于正常对照组（P<0.05）；大黄虫丸组与模型对照组相比无显著差异（P>0.05）。第7天模型对照组LPO活性与正常对照组相比无显著差异（P>0.05）；第14天模型对照组LPO活性显著高于正常对照组（P<0.05）；大黄虫丸组显著低于模型对照组（P<0.05）。结果见表3。表3  模型第7天、第14天SOD活性和LPO活性比较(略)
       4  讨论
        肺纤维化以进行性呼吸困难、喘息为主要特征，其次为刺激性干咳、或咳少量粘痰、或伴有胸痛、发热，晚期多出现杵状指、口唇紫绀等临床表现。中医根据该病以进行性呼吸困难为主症，或伴有咳嗽、咳痰等临床表现而将其归于“肺痿”“肺胀”等范围。综合有关文献［3，4］，一般认为肺纤维化的病机涉及气虚、阴虚、血瘀、痰浊等方面，多为虚实夹杂，或以本虚为主，或以标实为主。本虚为肺肾气阴两虚、标实为痰瘀阻于肺络。在治法上多是以益气养阴、活血化瘀、清热祛瘀为主［5～7］。
        大黄虫丸见于《金匮要略·血痹虚劳病脉并治第六》“五劳虚极羸瘦，腹满不能饮食，食伤、忧伤、饮伤、房室伤、饥伤、劳伤、经络营卫气伤，内有干血，肌肤甲错，两目黯黑。缓中补虚，大黄虫丸主之”，是治疗虚劳挟瘀的代表方，本方缓消瘀血，方中大黄、虫、桃仁、虻虫、水蛭、蛴螬、干漆活血搜络化瘀；地黄、芍药养血润燥；杏仁理气活血；黄芩清解郁热；甘草、白蜜益气和中。用于正气虚弱，脏腑功能低下，气血运行缓慢致瘀者。即大黄虫丸方证的病机和症状与肺纤维化后期表现相似。实验研究证实大黄虫丸能较好地减轻肝脏免疫性损伤，抑制纤维增生，防止肝组织纤维化［8，9］。
        肺纤维化多由于肺泡上皮结构和功能损伤，导致上皮基底膜裸出和断裂，激活的成纤维细胞从断裂的基底膜中间侵入肺泡腔内，粘附在肺泡腔内开始增殖，并向肌成纤维细胞转变，分泌纤维粘蛋白、蛋白多糖和胶原等纤维成分，形成肺泡和间质一体化的纤维化。本实验结果显示：造模后第7天大鼠肺部主要以炎性改变为主，尚未出现明显肺纤维化。第7天、第14天模型对照组肺泡炎Ridit值显著高于正常对照组（P<0.05），提示造模成功；大黄虫丸组显著低于模型对照组（P<0.05），提示此阶段大黄虫丸能够减轻平阳霉素所致大鼠肺泡炎程度；第14天出现了少量的胶原纤维，呈Ⅰ级肺纤维化改变。模型第14天模型对照组肺纤维化Ridit值显著高于正常对照组（P<0.05），提示造模成功；大黄虫丸组Ridit值显著低于模型对照组（P<0.05），提示大黄虫丸能够减轻模型肺纤维化程度。
        肺纤维化发病机制至今尚不清楚,目前许多实验表明,在肺纤维化发病过程中存在着下呼吸道氧化/抗氧化失衡［10］。活性氧如超氧阴离子及过氧化氢是多种疾病的重要介质。活性氧在平阳霉素造模后对肺纤维化的形成起关键性作用［11］。在正常的生理条件下,自由基引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制。但是,当这些抗氧化物不足以对抗大量的氧化物即氧化/抗氧化系统失衡时,组织就会发生不可逆性损伤。目前认为,下呼吸道氧化/抗氧化失衡的发生可能与中性粒细胞等炎性细胞在下呼吸道聚集有密切的关系。当肺组织受到损伤发生炎症时,中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎性细胞会聚集在下呼吸道,引起肺脏氧负荷过重。中性粒细胞可释放大量的氧自由基、花生四烯酸代谢产物和蛋白水解酶等,造成炎症持续和肺组织的损伤［12］。SOD能清除生物氧化过程中产生的超阴离子自由基,是机体有效清除活性氧的重要酶类之一,被称为生物体抗氧化系统的第一道防线［13］。研究发现［14］，平阳霉素致大鼠肺纤维化时血清SOD活性降低。因此，增强机体的抗氧化能力尤其是清除氧自由基的能力，对于肺纤维化的治疗具有重要的意义。
        氧自由基与炎症密切相关，它所引发的脂质过氧化对机体的主要损害是对生物膜的破坏，使膜的流动性下降，脆性增加，细胞易破裂。肺脏局部的炎症反应可导致自由基生成增多，从而使脂质过氧化作用增加，在造成损伤的同时又进一步引起自由基反应加强，反过来加重炎症反应和肺损伤。LPO是不饱和脂肪酸经自由基作用所形成的过氧化物。氧自由基和LPO能破坏生物膜和损害细胞功能,对免疫有抑制作用。测定LPO水平能了解自由基和过氧化脂质代谢与疾病的关系。由于LPO与衰老和多种疾病密切相关,对LPO的状态观察可作为疾病的诊断、预后和采取抗氧化治疗的一个十分有用的指标［12］，因此，脂质过氧化物(LPO)的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而LPO的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。有文献报告，氧自由基在肺纤维化的肺损伤中有一定作用，中医辨证为肺虚证者血中SOD下降LPO上升。宋卫东等的研究提示肺泡灌洗液中SOD 、LPO是评价肺气虚证的指标之一。
        本实验结果显示，第7天、第14天模型对照组SOD活性显著低于正常对照组（P<0.05），提示SOD活性降低可能是模型出现肺泡炎和肺纤维化的原因之一，可能是由于大量自由基产生，SOD被明显消耗或SOD活性受到一定程度抑制所致。大黄虫丸组与模型对照组相比无显著差异（P>0.05），提示大黄虫丸在模型第7天、第14天对SOD的影响不明显，可见在上述两阶段大黄虫丸防治肺泡炎和肺纤维化的作用机制可能与SOD变化关系不密切。模型对照组第7天LPO活性与正常对照组相比（P>0.05），提示模型第7天出现炎性反应可能与LPO关系不明显。模型第14天LPO活性显著高于正常对照组（P<0.05），提示LPO活性增高可能是模型出现肺泡炎和肺纤维化的原因之一；大黄虫丸组LPO显著低于模型对照组（P<0.05），提示降低LPO活性可能是该阶段大黄虫丸防治肺泡炎及肺纤维化有效的原因之一。
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