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       【摘要】 
       目的利用高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术研究防风中4种色原酮类化合物。方法实验采用反相C18色谱柱，乙腈和2%的醋酸溶剂体系梯度洗脱，分离防风中色原酮化合物，电喷雾质谱采用正离子模式。结果分离并检测了防风中4种色酮类化合物，并获得了化合物的液相保留时间、分子量以及化合物结构信息。结论高效液相色谱与电喷雾质联用技术能快速鉴定防风中色原酮类化合物。
       【关键词】  防风； 色原酮类化合物； 高效液相色谱与电喷雾质谱联用
       
       Analysis of Chromenes in Saposhnikovia Divaricala by Liquid Chromatography Electrospray-mass Spectrometry
       LI Li,LIU Zhijing,GUI Yuge,YAN Jing,LIU Chunming
       1.The Central Laboratory,Changchun Normal University,Changchun,130032 China;2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040 China
       Abstract：ObjectiveTo develop a liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry(LC-ESI-MS) method for the analysis and identification of chromenes in extract of Saposhnikovia divaricala.MethodsThe HPLC experiment was proceeded by means of a reversed-phase C18 column and a binary mobile phase system consisting of 2% acetic acid and acetonitle undergradient elution conditions.The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using electrospray ionization.ResultsFour major peaks were separated and detected,the molecularions［M+N］+ of chromones were obtained,and from which the molecular weights were obtained.The structures of the chromones(Peaks1～4) from the extract were elucidated according to the fragmentation patherns and the literature reports.ConclusionOur study demonstrated that LC-ESI-MS could be a highly useful technigue for rapid analysis of chromenes in plant extract of Saposhnikovia Dircuricata.
       Key words： Saposhnikovia divaricata;  Chromones;  HPLC-ESI
       
       防风为伞形科多年生草本植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk 的干燥根。药理研究表明，防风具有解热镇痛、镇静、抗炎、抗菌、抗过敏等多方面的药理作用［1，2］。防风中主要含有色原酮类、香豆素类以及多糖类等多种化学成分，而主要有效成分为色原酮化合物 ［3～9］。
        近年来，高效液相色谱法已成为分析防风色原酮类化合物的主要方法［6～9］。而防风中色原酮类化合物的分离方法通常采用硅胶或聚酰胺柱层析，这种分析方法通常情况下工作量较大，分离效率不高。而高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术在中药领域的广泛应用，使分析、鉴定中药复杂体系中的化学成分更加简便、快速［10，11］。有关防风中色原酮类化合物高效液相色谱与电喷雾质谱联用研究已有文献报道［12］，但该论文只给出有限的质谱信息。本文利用高效液相色谱与电喷雾质谱联用技术分析、鉴定了防风中的4种色原酮类化合物。结构式见图1。
       1  器材与方法
       1.1  仪器及实验条件高效液相色谱实验采用Agilent Technology 1100 Series HPLC系统，二极管阵列检测器（photodiode array detector，DAD），λ=254 nm；Agilent Extend-C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) 和 C18保护柱，柱温为25 ℃。实验中采用二元线性梯度洗脱，流动相组成为乙腈（A）,2%的醋酸水溶液（B）。流速为1.0 ml/min，样品分析时间为25 min。 流动相梯度：0～20 min，90% B～60% B；20～22 min, 60% B～0% B；22～25 min，0% B～90% B。样品进样量为10 μl。
        质谱分析采用(Finngan LCQ ion-trap, MAT, San Jose, CA, USA)电喷雾离子阱质谱。质谱检测采用正离子模式。扫描的质荷比范围为50～2 000。离子阱的条件：壳气(N2)：60 bar；辅助气(He)：10 bar；喷雾电压：5 kV；毛细管电压：-15 V；毛细管温度：270 ℃；Tube lens offset：-20 V；源内碰撞诱导解离(in-source CID)的碰撞能为40%。
       1.2  试剂与材料所用试剂均为分析纯(北京化工厂) ；防风S. divaricata药材购于北京同仁堂药店(长春分店) 。
       1.3  样品制备精密称取防风药材粉末2.032 3 g， 用50 ml 80%的乙醇于室温下超声提取2次，0.5 h/次。将80%乙醇提取液过滤，合并滤液。减压蒸馏回收乙醇溶液, 蒸至40 ml (水溶液)。将水溶液部分用正己烷脱脂2次，40 ml/次，弃去正己烷溶液，水溶液部分再用水饱和正丁醇萃取3次，40 ml/次，合并正丁醇层，减压蒸馏回收至干(<40℃) ，残渣用5 ml 80%乙醇溶解，得样品溶液，用于电喷雾质谱分析。
       2  结果
        图2为防风正丁醇提取物的高效液相色谱图。通过图2可以看出，防风中的4种色原酮化合物在上述色谱条件下得到很好的分离，化合物1～4相应的液相色谱保留时间分别为9.17，11.79，12.21和17.09分。在高效液相色谱与电喷雾质谱实验中，防风中的色原酮化合物在正离子条件下丰度较大，主要出现［M+1］+ 离子峰，分别为m/z 469, 307, 453和291，因此，通过HPLC-ESI正离子谱获得色谱峰1～4对应化合物的分子量分别为468，306，452和290。通过与文献［3～5，12］对比，可以初步推断化合物1～4分别 为升麻素苷，升麻素，5-O-甲基维斯阿米醇苷，5-O-甲基维斯阿米醇，可能的结构式见图1，通过图1 可以看出，这4个化合物具有类似的结构式。
       
       为了进一步验证这些色谱峰的化学结构，在相同的条件下做了质谱的源内碰撞诱导解离实验，得到相应化合物的碎片信息，实验数据列于表1。表1  正离子模式下色谱峰1～4的液质联用数据（略）
        如表1所示，在源内C ID 实验中, 色谱峰1的准分子离子［M+H ］ + (m/z469)主要形成3个主要的分子离子峰，分别为m/z307，289和235。m/z 469离子失去一个质量数为162的中性碎片（一分子的葡萄糖基）后生成［M-162 +H ］ + ( m/z 307)的离子；m/z 469离子同时失去一个质量数为162的中性碎片（一分子的葡萄糖基）和一个质量数为18的中性碎片（一个水分子），生成［M - 180 + H］ + (m/z 289)的离子； m/z 469离子丢失C5位上的CH3OH和C4′位上的O-Glu基团，生成m/z259的碎片离子。该断裂规律符合升麻素苷的结构特点，进一步确定峰1为升麻素苷。
        化合物2的分子离子峰为［M+H ］ + (m/z 307)，因此可确定化合物2的分子量为306，通过与文献［3～5，12］对比，与升麻素的分子量一致，与升麻素苷的分子量相差162。在源内C ID 实验中, 色谱峰2的准分子离子［M+H］ + (m/z 307)形成3个主要的分子离子峰，分别为m/z289，259和235。m/z 289和259离子的碎裂规律与化合物1的碎裂规律一致，这进一步肯定了我们前面的推测。而m/z 307离子从C2′和C3′开环生成［M - 72 + H］ + (m/z 235)的离子。由此进一步确定峰2为升麻素。
        化合物3的分子离子峰为［M+H］+ (m/z 453)，因此可确定化合物2的分子量为452，通过与文献［3～5，12］对比，与5-O-甲基维斯阿米醇苷的分子量一致。如表1所示，在源内C ID 实验中，m/z 453离子形成四个主要的分子离子峰，分别为m/z291，273，243和219。m/z453离子失去一个质量数为162的中性碎片（一分子的葡萄糖基）后生成［M-162 +H］ + ( m/z 291)的离子；m/z 453离子同时失去一个质量数为162的中性碎片（一分子的葡萄糖基）和一个质量数为18的中性碎片（一个水分子），生成［M - 180 + H］+ (m/z 273)的离子；m/z 453离子丢失C5位上的CH3OH和C4′位上的O-Glu基团，生成m/z243的碎片离子；而m/z 219离子是母离子丢失一分子的葡萄糖基，5位上CH3OH基团，4位上的羰基开环形成的离子，该断裂规律符合5-O-甲基维斯阿米醇苷的结构特点，进一步确定峰3为5-O-甲基维斯阿米醇苷。
        化合物4的分子离子峰为［M+H］ + (m/z 291)，因此可确定化合物2的分子量为290，通过与文献［3～5，12］对比，与5-O-甲基维斯阿米醇的分子量一致，化合物3和4的分子量相差162（葡萄糖基）。而m/z 453离子在二级串联质谱中丢失一个质量数为162的中性碎片（一分子的葡萄糖基）后生成［M-162 +H］ + ( m/z 291)的离子，也进一步说明化合物3的分子结构比化合物4多一个葡萄糖基。如表1所示，在源内C ID 实验中，m/z 291离子形成3个主要的分子离子峰，分别为m/z273，243和219。与m/z 453离子具有类似的碎裂规律，该断裂规律进一步确定峰4为5-O-甲基维斯阿米醇。
       3  讨论
       　　   
       实验结果表明，通过高效液相色谱与电喷雾质谱联用，可以获得相应化合物的分子量信息，而结合源内CID技术, 可以通过一些中性碎片的丢失，推断出化合物的结构，从而可以快速分析鉴定防风中的化合物。虽然不是化合物结构的最终确定，但确实为植物粗提物化合物结构快速分析的简单有效方法。
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