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       【摘要】 
       目的观察蜂胶总黄酮对D-半乳糖诱导衰老小鼠学习记忆的影响，并对其机制进行了初步探讨。方法将筛选后昆明种小鼠随机分为空白组，模型组，蜂胶总黄酮低、中、高(30，60，90 mg/kg）3个剂量组。除空白组外采用颈背部皮下注射D-半乳糖复制衰老模型。各组动物以Y型迷宫试验检测学习记忆能力，Y型迷宫结束后取脑组织测定乙酰胆碱酯酶(Ach -E)、单胺氧化酶（MAO-B）、丙二醛(MDA)、脂褐素(LF)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果蜂胶总黄酮能明显改善衰老小鼠的学习记忆能力，使Y型迷宫测试错误次数减少。蜂胶总黄酮能明显提高衰老小鼠脑组织乙酰胆碱酯酶活性，降低单胺氧化酶水平，并且使过氧化产物丙二醛、脂褐素含量降低，而超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性增高。结论蜂胶总黄酮具有抗衰老及促进学习记忆能力的作用，其作用机制可能与抗氧化及影响神经介质有关。
       【关键词】  蜂胶； 黄酮； 学习记忆； 脂褐素； 单胺氧化酶； 衰老
       黄酮类化合物是中草药的主要有效成分之一，具有多种生物学活性。近年来对于其抗衰老作用研究较多。研究发现，淫羊藿总黄酮、银杏叶总黄酮、大豆黄酮等具有明显的抗衰老作用［1～3］。蜂胶(Propolis)是蜜蜂从植物芽孢或树干采集的蜂蜜，混入蜜蜂上颌腺分泌物和蜂蜡后加工制成的芳香味的胶状固体物质，现作为一种保健品被广泛应用。蜂胶中含有丰富的黄酮类物质，中国医学科学院药用植物研究所郭伽等［4］报道，蜂胶中已发现的黄酮类化合物有71种之多。目前对于蜂胶黄酮抗衰老作用的实验研究较少。本课题组前期研究发现蜂胶醇提物具有明显的促进小鼠学习记忆作用［5］，在此基础上，本文以D-半乳糖诱导衰老小鼠模型，观察蜂胶总黄酮的抗衰老作用及相关的作用环节，以期为蜂胶抗衰老作用的开发提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物选择清洁级昆明种小鼠，18～22 g，由泰山医学院实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字020103。
       1.2  药物蜂胶原胶，由山东省实验种蜂厂提供。参照文献［6］，超声法提取蜂胶总黄酮，临用前0.15%吐温80溶解，配成所需浓度备用。参照文献［7］，以芦丁为标准品，用比色法测定总黄酮含量。以吸光度值A510nm为纵坐标，浓度为横坐标，得标准曲线方程为A=5.864 3C+0.020 8 （R2=0.991 7）。测得蜂胶总黄酮的吸光度为0.354，代入标准曲线方程，按生药量计算得蜂胶总黄酮的含量为15.82 mg/g。
       1.3  试剂与仪器D-半乳糖，Amresco生产，上海贝基生物技术有限公司分装，批号：0637，临用前用生理盐水配制合适浓度。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，批号：20080327；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒，批号20080228；丙二醛（MDA）试剂盒，批号20080315；脂褐素（LF）试剂盒，批号20080309；乙酰胆碱酯酶（AchE）试剂盒，批号20080522；B型单胺氧化酶（MAO-B）试剂盒，批号20080420；考马斯亮蓝测定试剂盒，批号20080510，均购自南京建成生物工程研究所。芦丁标准品，批号：0080200105，中国药品生物制品检定所提供。
       
       KQ-600DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；WGC迷宫刺激器，安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司生产；752S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司生产；RF-5301PC荧光分光光度计，日本岛津生产。
       2  方法
       2.1  动物筛选、分组、给药及模型的制备［8］取2月龄昆明种小鼠若干只进行筛选，将小鼠放入Y-型迷宫箱中适应1～2 min，给予适当电击，至其对3臂均探索进入为止，选择活跃，对电击反应较敏感的小鼠，过于敏感和迟钝小鼠被淘汰。筛选80只小鼠随机分为5组，分别为空白对照组，模型组，蜂胶总黄酮低、中、高3个剂量（30，60，90 mg/kg）组，每组16只(雌雄各半) 。灌胃给药，蜂胶总黄酮3个剂量组灌胃各剂量的蜂胶总黄酮，空白对照组及模型组给予等容量生理盐水，连续6周。灌胃同时除空白对照组颈背部皮下注射等容量生理盐水外，其余各组小鼠注射D-半乳糖150 mg/kg，1次/d，连续6周，制备衰老模型。末次给药后，进行Y型迷宫试验。
       2.2  Y型迷宫试验［9］迷宫共分为3个互通的臂，实验测试时，工作电压50～70 V，以A为起步区，B为安全区，C为危险区，小鼠在起步区受到电击后,1次性跑入安全区为正确，否则为错误，即为1次训练。下1次训练以B为起步区，C为安全区，A为危险区，依次往复。共训练33次，其中前3次作为小鼠适应环境不进入统计，记录后30次中的错误次数，为学习成绩。24 h后，用同样的方法测试，为记忆成绩。
       2.3  脑组织生化指标的测定Y型迷宫测试后，将小鼠快速断头处死，随机每组选取8只，取其脑组织制成10%水相脑匀浆，测定脂褐素含量；另外8只取其脑组织用生理盐水制成10%脑匀浆，3 000 r/min低温离心10 min，取上清液测定SOD，GSH-Px，MAO-B，AchE活性及MDA、LF含量。考马斯亮蓝作蛋白定量。具体步骤严格遵循试剂盒说明书执行。
       2.4  统计学处理所有数据用±ｓ表示，使用SPSS14.0软件进行统计分析，组间显著性检验采用单因素方差分析。
       3  结果
       3.1  蜂胶总黄酮对衰老模型小鼠学习记忆功能的影响与对照组相比，模型组小鼠学习记忆功能明显衰退，表现为学习成绩和记忆成绩的错误次数均明显增多（P<0.01），说明建模成功。与衰老模型组相比，蜂胶总黄酮3个剂量组能明显降低小鼠的错误次数（P<0.01或P<0.05），说明蜂胶总黄酮能改善衰老小鼠的学习记忆能力。结果见表1。表1  蜂胶总黄酮对衰老小鼠学习记忆的影响（略）
       3.2  蜂胶总黄酮对衰老模型小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性及MDA、LF含量的影响与对照组相比，模型组SOD、GSH-Px活性明显降低，MDA、LF含量明显升高（P＜0.01或P＜0.05），符合小鼠衰老规律。与衰老模型组相比，蜂胶总黄酮60，90 mg/kg剂量组SOD、GSH-Px活性显著提高（P＜0.01或P＜0.05），而 MDA、LF含量蜂胶总黄酮3个剂量组都明显下降（P＜0.01）。说明蜂胶总黄酮能提高衰老小鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性，降低MDA、LF含量，减轻模型鼠的过氧化损伤。结果见表2。表2  蜂胶总黄酮对衰老小鼠脑组织SOD ，GSH-PX，MDA，LP 含量的影响（略）
       3.3  蜂胶总黄酮对衰老模型小鼠脑组织MAO-B、AchE活性的影响与对照组相比，衰老小鼠脑组织AchE活性降低，MAO-B活性升高。给予蜂胶总黄酮后，3个剂量组MAO-B活性明显降低（P＜0.01），而60，90 mg/kg剂量组AchE活性明显提高（P＜0.01）。说明蜂胶总黄酮可通过影响中枢神经递质发挥其抗衰老作用。结果见表3。表3  蜂胶总黄酮对衰老小鼠脑组织 MAO-B，AchE活性的影响（略）
       4  讨论
          
       D-半乳糖致衰老模型是基于衰老的代谢学说而复制的一种衰老模型，是目前最常用的制备衰老动物模型的方法，其衰老反应接近或相当于自然衰老。研究表明［10］，D-半乳糖造成的衰老模型可使实验动物出现认知功能障碍，本研究结果也表明，皮下注射D-半乳糖6周后，小鼠学习实验与记忆实验错误次数明显增多，学习记忆能力下降。而在D-半乳糖造模的同时给以蜂胶总黄酮，可明显改善小鼠的学习记忆能力。提示蜂胶总黄酮具有益智的功效，这与先前的实验结果一致［5］。
       
       D-半乳糖致衰老模型具有与自然衰老相似的自由基代谢紊乱特征［11］。主要表现为脂质过氧化产物MDA生成增多、脂褐素沉积、清除自由基酶类GSH-Px、SOD的活性降低［12］，这在本实验中得到了进一步证实。MDA是过氧化脂质的分解产物，它产量的多少可表示过氧化程度的大小；而脂褐素是MDA与大分子交联的产物，它的沉积是衰老的一种标志。SOD能促使超氧化物阴离子自由基变为过氧化氢和氧离子，GSH-Px能特异性催化谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，使自由基得到清除。研究表明，蜂胶黄酮具有显著的抗氧化作用［13］。本实验研究发现蜂胶总黄酮通过提高脑组织中SOD、GSH-Px活性，降低MDA、脂褐素水平，提高衰老小鼠脑组织清除自由基的能力，减少过氧化产物对脑组织的损伤，进而降低脑老化的程度，发挥其抗衰老作用。
       
       本研究还发现D-半乳糖致衰老模型可使MAO-B水平提高、AchE活性降低，这与文献报道一致［14］。单胺类神经递质与学习和注意力关系密切。单胺氧化酶可以氧化分解单胺类神经递质，从而影响学习和记忆功能。蜂胶总黄酮可以抑制MAO-B的活性，因此提示蜂胶总黄酮可能通过减少单胺类神经递质分解的途径来改善大鼠的学习和记忆功能。中枢胆碱能系统与学习记忆功能密切相关。研究发现阿尔茨海默病（Alzh -eimer"s disease, AD）患者大脑皮层内胆碱乙酰基转移酶、AchE活性和M受体含量均下降［15,16］。蜂胶总黄酮能显著提高AchE活性，提示蜂胶总黄酮可通过改善中枢胆碱能系统功能发挥抗衰老作用。
       【参考文献】
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