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       【摘要】 
       目的观察复元胶囊对实验性大鼠骨关节炎软骨中的TNF-α和VEGF的影响。方法56只SD大鼠随机分为：正常对照组6只，生理盐水灌胃；模型对照组10只，造模后生理盐水灌胃；四环素组，复元胶囊低、中、高剂量组各10只，造模后分别用四环素、复元胶囊不同剂量灌胃。治疗10周后分别取各组胫骨平台关节软骨，采用HE染色进行Mankin’s评分，免疫组织化学染色法测定关节软骨中的TNF-α和VEGF表达的阳性细胞数。结果正常对照组HE染色Mankin’s评分与实验组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。各组关节软骨切片TNF-α和VEGF免疫组化染色分析，正常对照组TNF-α和VEGF与实验组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论复元胶囊可能通过调控TNF-α和VEGF抑制炎症和血管增生，从而达到延缓关节软骨退行性改变的作用。
       【关键词】  骨关节炎； 复元胶囊； 软骨； 肿瘤坏死因子α； 血管内皮生长因子
       Effects of FuYuan Capsule on Tumor Necrosis Factor-alpha and Vascular Endothelial Growth Factor in Cartiage Cells of Experimental Osteoporosis Rats
       TANG Jing，LI Rongheng，ZHOU Xiaoli
       （1.Department of Traditional Chinese and Western Medicine, the First Affiliated Hospital , Chongqing Medical University，Chongqing 400016；2.First Pople"s Hospital of Chongqing,Chongqing 400011）
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of FuYuan Capsule on tumor necrosis factor-alpha （TNF-α）and vascular endothelial growth factor （VEGF）in osteoarthritis（OA）.MethodsFifty-six Spragne Dawley（SD）rats，were randomly divided into five groups: normal group with 6 rats,model contrast group with 10 rats,tetracycline group with 10 rats,FuYuan capsule low,moderate and high does group with 10 rats.The normal group and model contrast group were fed with 0.9 N.S,tetracycline group were fed with tetracycline and others with FuYuan Capsule.After 10 weeks, the rats were sacrificed，and then rat tibiaarticular cartilage was removed. Sections of the articular cartilage were stained with hematoxylineosin.The cartilage histological changes were observed according to the method of Mankin.Immunohistochemical staining was performed to investigate the expression of TNF-α and VEGF.Articular cartilage were observed  with microscope and image analysis method was used to measure the expression intensity of TNF-α and VEGF.ResultsThere were significant differences in Mankin score among normal group and other groups（P＜0.05）. Immunohistochemical staining indicated that the expression intensity of TNF-α  and VEGF among normal group and experimental groups were significantly different （P＜0.05）. ConclusionFuYuan capsule can protect the articular cartilage through suppressing the TNF-αand VEGF expression in chondrocyte ，with suppressing inflammation and andangiogenesis.
       Key words：Osteoarthritis；  FuYuan Capsule；  Cartilage；  Tumor necrosis factor-alpha；  Vascular endothelial growth factor
       
       骨性关节炎（osteoporosis OA）是以中老年人为主的最常见的关节退行性疾病。主要以关节软骨生化代谢异常， 关节边缘和软骨下骨损伤， 使得骨质增生，骨关节内组织炎性病变为其病理特点，并最终导致关节疼痛、僵硬和功能障碍。国内外有研究表明，骨性关节炎的发生与肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的调控密切相关［1］。复元胶囊是由临床上长期用于治疗骨关节炎有效的经验方研制而成的中药复方制剂。目前研究发现复元胶囊能促进软骨增殖而修复软骨［2］。为进一步阐明其确切治疗机制，本研究采用Hulth法建立大鼠膝OA模型后，给予复元胶囊灌胃治疗，免疫组化法测定TNF-α、VEGF的蛋白质水平变化，探讨复元胶囊能否通过调控TNF-α和VEGF而延缓关节软骨退行性改变。
       1  材料
       1.1   动物♂10周龄SD大鼠56只，体质量（350±10）g，由重庆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SYXK(渝)2002007，普通级。
       1.2   药物及试剂
       复元胶囊由人参、淫羊藿、鹿角胶、黄芪、川芎、三七等组成，委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊，每粒胶囊重0.41 g，每克粉末相当于生药3 g，仅供实验使用。四环素片剂，西南药业股份有限公司，国药准字H50021768，规格0.25 g。TNF-α和VEGF试剂盒，购于武汉博士德生物工程有限公司。
       2  方法
       2.1   OA模型建立
       采用Hulth法构建大鼠膝OA模型。5%水合氯醛腹腔注射(水合氯醛0.7 ml/100 g），麻醉后纵行切开右侧后膝部内侧皮肤，切断内侧副韧带，打开关节腔，切除内侧半月板， 切断前后交叉韧带，术中避免关节面软骨人为损伤。彻底止血，逐层缝合伤口组织，无菌包扎固定。术后用青霉素8×104U·kg-1肌注7 d预防感染。术后一周每天驱赶大鼠30 m，连续10周。
       2.2  分组造模后存活的50只SD大鼠随机分为5组：模型对照组10只；治疗组又分为低、中、高剂量组，每组各10只；四环素组10只。另外6只为正常对照组。
       
       2.3  给药方法
       根据Meeh-Rutw公式计算大鼠的给药剂量。治疗组造模后第1周开始按不同剂量的复元胶囊分别给予低、中、高剂量灌胃(371.65，743.30，2 229.90·kg-1·d-1)连续10周；四环素组造模后第1周开始给予50 mg·kg-1·d-1灌胃10周；正常组和模型组分别给予3 ml生理盐水灌胃10周。
       2.4  标本采集及检测方法
       于右侧胫骨平台取关节软骨，置于4%多聚甲醛固定，100 g/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）脱钙4周，每周换液一次，4周后石蜡包埋、切片，HE染色进行Mankin’s评分，免疫组织化学法检测TNF-α和VEGF的蛋白表达。
       2.5  图像分析
       每个标本取5张切片，每张切片在显微镜下放大400×，随即取5个视野，采用细胞图像分析系统和医学图像分析软件，阳性强度用阳性细胞数表示。
       2.6  统计学分析
       用SPSS12.0软件处理，数据以±s表示，用方差分析和组间数据比较，P＜0.05有统计学意义。
       3  结果
       3.1  大体观察正常对照组: 胫骨平台面呈半圆形，表面光滑，无增生迹象；实验组：右侧关节肿大，软骨表面粗糙，局部凹凸不平, 关节面糜烂，多数形成软骨溃疡 ,深浅不一，有赘生物形成，关节腔内有关节液。大体观察见造模成功。
       3.2  光镜下观察和Mankin’s评分 Mankin’s骨关节炎评分法：1～5为早期，6～9分为中期，10～14为晚期。正常对照组:关节软骨4层结构清晰,软骨面光滑、完整,软骨细胞排列整齐,基质染色均匀；模型组：滑膜部分呈结节样增生，软骨细胞减少，软骨下骨暴露，骨赘形成，血管增生明显，潮线不完整或消失；四环素组：滑膜增生明显，软骨裂隙深达表层，软骨细胞较多；复元胶囊低剂量组：滑膜部分增生较明显，软骨细胞减少，基质染色不均，有大量炎症细胞浸润，血管和大量纤维组织增生明显；复元胶囊中、高剂量组：滑膜增生可见，大部分细胞稀疏，双重潮线，有少量的炎症细胞，血管和纤维组织稀疏散在分布。结果见表1。表1  10周各组动物软骨评分（略）
       3.3  免疫组织化学检测TNF-α的表达  
       TNF-α免疫组化染色阳性表达为棕色，位于胞浆中。正常对照组软骨细胞中没有TNF-α阳性表达；模型对照组全层软骨细胞浆中均有TNF-α表达。FY胶囊高、中剂量组和四环素组表层阳性细胞较少，深层见少量阳性细胞。FY胶囊低剂量组表层和深层有大量阳性细胞。结果见表2。
       3.4  免疫组织化学检测的表达
       VEGF免疫组化染色阳性表达为黄褐色，位于胞浆中。正常对照组软骨细胞中没有VEGF阳性表达。模型对照组软骨细胞表层和移行层胞浆均有VEGF表达，呈黄褐色。FY胶囊高、中剂量组和四环素组表层和移行层有散在的浅黄褐色。FY胶囊低剂量组表层和移行层胞浆中有大量呈浅黄褐色阳性细胞。结果见表2,图1～2。表2  软骨细胞TNF-α和VEGF表达的阳性细胞率（略）
       4  结论
       4.1  骨关节炎与VEGF 
       血管内皮生长因子 (VEGF)是20世纪80年代早期由Senger发现的,因具有促进血管渗透的作用,又被称为血管渗透因子（VPF)［3］。目前的研究认为促血管生成参与OA的发病过程,但具体的机制仍不清楚。近年的研究发现，VEGF不仅吸引内皮细胞到病变部位,而且也招募软骨细胞、破骨细胞等［4，5］。VEGF是新生血管形成最关键的细胞因子,是目前发现的功能最强大的内皮细胞有丝分裂原,可通过旁分泌机制促进内皮细胞快速分裂增殖,诱导新生血管形成；另外,VEGF还能诱导某些酶高表达,增加微血管通透性,为新生血管形成创造条件［6］。众所周知,关节软骨是无血管无淋巴的组织,这提示VEGF能诱导生成更多的破骨细胞参与软骨破坏且导致血管更易侵袭入软骨［7］。因此我们推断OA软骨中升高的VEGF一方面发挥促血管生成作用,另一方面吸引破骨细胞到病变部位,破坏正常的软骨。在OA病程进展中，血管生成与慢性炎症关系密切。慢性炎症的组织中含有大量的炎症细胞、新生血管和炎症介质，炎症介质直接或间接地促进血管生成。OA血管生成不仅可导致炎症，更重要的是炎症持续、反应通过新生血管转运炎症因子得以维持［8］。最近一份研究报告表明，颞下颌关节炎的患者中VEGF表达的增加随着滑膜的炎症加剧而增加。Haywood［9］等指出VEGF产生滑膜巨噬细胞可能是加剧骨关节炎的分子机制，巨噬细胞可能介导了骨关节炎血管生成和炎症的发生。
       4.2  骨关节炎与TNF-α
       TNF-α是一种由内毒素激活的巨噬细胞产生的仅对癌细胞有杀伤作用而对正常细胞无细胞毒作用的非种属特异性活性因子。近年来研究表明，与软骨破坏相关的单核因子白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌异常，是OA发病的中心环节。TNF-α和IL-1只有3％的同源性，但TNF-α于靶组织的效应与IL-1在很大程度上类似，其生物学活性作用比IL-1的生物学作用低100倍，且不能激活鼠T细胞效应。但TNF-α可激活多型核细胞．刺激滑膜细胞的PGE2产生，增加骨、软骨的破坏；此外TNF-α能诱导其它细胞因子，包括IL-1、单核粒细胞刺激因子的产生，而IL-1能提高TNF-α的活性［10］，因此TNF-α在OA的发病中与IL-1起着协同作用。现有试验证实，TNF-α抗体及其受体拮抗药可明显减轻关节炎症状，抑制血管生成［11］。
       4.3  对照药物选择
       近年来，针对OA治疗的药物研究不断地深入，四环素类非抗生素作用在OA治疗中的作用，逐渐得到人们重视。目前已证实，四环素家族能从多个方面有效抑制炎症，阻止炎症介质对软骨进一步破坏。四环素能通过阻断细胞因子的转录抑制脂多糖诱导的细胞因子的IL-1及TNF-α分泌［12］，抑制MMPs的活性［13］，减轻和阻止了软骨基质的降解作用。本实验选择四环素作为对照药物，结果发现四环素组的疗效与FY胶囊中剂量相当，而FY胶囊高剂量组的疗效明显优于四环素组。
       4.4  中医对骨关节炎的认识
       OA属中医的“骨痹”范畴。《内经·痹论》指出: “风寒湿三气杂至,合而为痹”，“所谓痹者，各以其时重感于风寒湿之气也”，因此痹症形成主要是由于年老体虚、跌仆损伤、饮食、药物失当，内虚外感风寒湿热之邪所致。《中藏经· 五痹》谓“骨痹者,乃嗜欲不节,伤于肾也 ……则邪气妄入”,指出邪气闭阻经络,气血瘀滞,经络不通,瘀血归肝,肝阴暗耗;肝肾同源,久则肝肾同虚,不能荣筋主骨,痹阻骨节筋脉,筋骨痿挛而为病。因此，治疗上予以补益肝肾，益气活血。FY胶囊方中有淫羊藿、鹿角胶、肉苁蓉等补肾阴肾阳，黄芪、生晒参等益气，辅以丹参、川芎、三七活血化瘀。全方标本兼治，以补肝肾为主，活血化瘀为辅。现代药理证实，人参皂苷能抑制巨噬细胞过量分泌TNF-α，从而使TNF-α的分泌水平下降［14］，淫羊藿对巨噬细胞分泌IL-1和TNF-α具有双向调节作用［15］。川芎嗪、三七总皂苷和丹参酮可下调VEGF表达，并能通过疏通微循环，加快病理产物的吸收，促进软骨细胞的修复，改善关节功能［16，17］。
       
       本实验结果表明，TNF-α和VEGF是介导炎症和血管增生的关键因子。复元胶囊可能通过抑制巨噬细胞分泌的途径，下调TNF-α和VEGF在OA软骨细胞中的表达，抑制了炎症和血管增生，从而达到延缓关节软骨退行性改变的作用。
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