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       【摘要】 
       目的对微波-超声辅助提取桔皮中总黄酮的工艺条件及参数进行优化。方法在单因素实验的基础上, 采用L9(34)正交设计，以桔皮总黄酮提取率为指标，探讨料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度对提取率的影响。结果最佳提取工艺参数为: 提取温度80 ℃、提取时间60 min、乙醇浓度φ=60 %、料液比1∶40。结论采用微波-超声辅助协同提取桔皮中总黄酮工艺简单可行，是提取桔皮中总黄酮的有效工艺之一。用于提取桔皮中的总黄酮，结果满意，回收率为98.6 %～102.3 %, RSD为1.6 %。
       【关键词】  桔皮； 总黄酮； 微波-超声辅助协同提取； 正交实验
       柑桔为芸香科柑桔属植物，其干燥果皮为药材陈皮，具有理气健脾、燥湿化痰作用。近年来研究表明，桔皮含有丰富的黄酮类物质，黄酮类化合物是自然界中广泛存在的一类天然产物，药理学研究表明其具有抗炎［1］、抗氧化［2，3］、抗过敏作用［4］以及降低血液和肝脏中胆固醇的作用［5］。
       
       提取桔皮中总黄酮的方法有：酶辅助提取法［6］，超声波辅助提取法［7］，微波辅助提取法［8］，有机溶剂提取法［9］。但迄今对桔皮中总黄酮的微波-超声辅助协同提取工艺未见报道。微波-超声协同萃取是近年发展起来的一种新方法，具有简单、快速、高效的特点，已被用于天然产物有效成分的提取，尤其在黄酮类、萜类、多糖等有效成分的提取上效果更好。本文研究了采用该技术提取桔皮中总黄酮的最佳工艺条件。
       1  器材
       1.1  材料芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)；桔皮(广州致信中药饮片有限公司)，购自广东药学院附属门诊部药房：将桔皮粉碎，用折叠成筒状的滤纸装好，加入100 ml石油醚冷浸24 h，然后将其置于80 ℃水浴中，使其微沸回流反复提取，直至提取液澄清为止，取出冷却至室温。抽滤，滤渣用石油醚充分洗涤后，风干至石油醚全部挥发，得到去除色素和油脂的桔皮粉末。
       
       实验用水为双蒸水；所用试剂均分析纯。
       1.2  仪器 CW-2000型超声波-微波协同萃取仪(上海新拓微波溶样测试技术有限公司)；Ｕ3010紫外可见分光光度计(日本日立公司)；722型光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；HH-6电子恒温水浴锅(苏州威尔试验用品有限公司)；FA2104电子分析天平(上海天平仪器厂)。
       2  方法与结果
       2.1  标准曲线的制备称取在120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品0.200 0 g，置于100 ml 量瓶中，加乙醇70 ml，置于水浴上微热使溶解，冷却至室温，加乙醇至刻度，摇匀。精密吸取10 ml，置于100 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得0. 2 mg/ml 芦丁对照品溶液。精密量取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml，分别置25 ml 量瓶中，加乙醇至6 ml，加ρ(NaNO2)=5 %亚硝酸钠溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加ρ［Al(NO3)3］= 10 %硝酸铝溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加ρ(NaOH)=5 %氢氧化钠试液10.0 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以乙醇为参比，用1 cm比色皿，于U3010紫外可见分光光度计上，在400～600 nm 波长处进行扫描。结果表明，对照品溶液在510 nm 处有最大吸收，因此选择510 nm 作为测定波长。在510 nm 波长处测定体系的吸收度，以吸收度(A)为纵坐标、浓度ρ芦丁(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Ａ=0.011 52 ρ芦丁+ 0.006  8 (r=0.999 4)。结果表明，芦丁对照品在所试浓度0.00～56.00 μg/ml范围内呈良好的线性关系。
       2.2  提取溶剂的选择
       2.2.1  水提取称取去除色素和油脂的桔皮粉末1.000 0 g于超声-微波协同萃取仪中，加水40 ml，混匀，在超声装置开启、提取温度为80 ℃时，提取60 min。趁热过滤至100 ml容量瓶中，药渣用少量水洗涤3次，每次过滤。并入滤液，冷却，用水定容后备用。
       2.2.2  乙醇提取称取去除色素和油脂的桔皮粉末1.000 0 ｇ在超声-微波协同萃取仪中，加φ=60 %乙醇40 ml，混匀，在超声装置开启、提取温度为80 ℃时，提取60 min。趁热过滤至100 ml容量瓶中。药渣用少量乙醇洗涤3次，每次过滤。并入滤液，冷却，用乙醇定容后备用。
       2.2.3  样品溶液总黄酮含量测定移取样品液1.00 ml于25 ml容量瓶中，按标准曲线制备方法进行操作、显色，测定吸光度，由标准曲线得到样品中总黄酮含量。结果见表1。表1  提取溶剂与总黄酮产率的关系（略）
       
       由表1可知，以乙醇作溶剂的提取法优于以水为溶剂的提取法。用水做溶剂提取黄酮虽然存在生产成本低，无溶剂残留的优点，但存在提取率较低，提取液存放易腐败变质，后续的过滤、浓缩操作困难且费时等不足，因此本实验选择乙醇作为提取溶剂。
       2.2.4  超声开与超声关对总黄酮提取率的影响在料液比1∶40，温度为80 ℃，提取时间为60 min的情况下，超声装置开启与超声装置关闭时总黄酮的提取率结果见表2。表2  超声装置开启与关闭对总黄酮提取率的影响（略）
       由表2可以看出，超声装置开启的总黄酮提取率为5.48 %，比超声装置关闭的时候高0.90 %，因为在超声提取条件下，超声波能产生高频振荡，强化传质，同时对植物的细胞壁有破碎作用，大大降低了传质阻力，另外超声热效应更加快了活性成分的溶解速度，增大了溶解度，因此超声装置开启比超声装置关闭更适合萃取，以下实验都设置为超声装置开。
       2.3  微波-超声辅助协同提取桔皮总黄酮工艺单因素试验称取一定量的桔皮粉末，按照“2.2.2”项下乙醇提取实验方法，采用单因数变换法分别试验提取时间，乙醇浓度，提取温度，料液比对桔皮总黄酮提取率的影响。
       2.3.1  乙醇浓度对桔皮总黄酮提取率的影响 在超声装置开启、料液比1∶40、提取温度为80 ℃、提取时间为 60 min时，实验不同乙醇浓度对桔皮总黄酮提取率的影响。在不同乙醇浓度情况下进行总黄酮提取，测定并计算总黄酮提取率。结果见表3。表3  乙醇浓度对桔皮总黄酮提取率的影响（略）
       
       由表3看出，当乙醇浓度增大时，总黄酮提取率也随之提高，但乙醇浓度高于φ=60 ％后，提取率有所下降。可能是由于高浓度乙醇使细胞内蛋白质凝固，影响总黄酮的溶出［10］；同时因为黄酮糖苷是由两部分组成，苷元成分不易溶于水，而糖又易溶于水，因此在提取黄酮类化合物时，只有乙醇与水达到最佳比例时，提取率最高。故选择60 ％乙醇为提取浓度。
       2.3.2  料液比对桔皮总黄酮提取率的影响将超声装置开启，以φ=60 %乙醇为提取溶剂、提取温度为80 ℃、提取时间为60 min时，试验不同料液比对桔皮总黄酮提取率的影响。在不同料液比条件下进行提取，分别测定黄酮提取率。结果见表4。表4  料液比对桔皮总黄酮提取率的影响（略）
       由表4看出，随着提取液用量的增加，桔皮总黄酮提取率增加，到达1∶40时提取率达到最高，之后随料液比的增加而总黄酮提取率趋于下降。实验选择料液比为1∶40。
       2.3.3  提取时间对桔皮总黄酮提取率的影响在超声装置开启、提取温度为80 ℃、乙醇浓度为φ=60 ％、料液比为1∶40时，试验不同提取时间对桔皮中总黄酮提取率的影响。当改变提取时间时，分别测定总黄酮提取率。结果见表5。表5  提取时间对桔皮总黄酮提取率的影响（略）
       由表5看出，开始时随提取时间的延长，桔皮总黄酮提取率增加，60 min时提取率最高；之后随提取时间延长，总黄酮提取率呈下降趋势，可能是高温使蛋白质凝固，造成黄酮不易溶出。选择提取时间为60 min。
       2.3.4  提取温度对桔皮总黄酮提取率的影响在超声装置开启、提取时间为60 min、乙醇浓度为φ=60 ％、料液比为1∶40时，试验不同提取温度对桔皮中总黄酮提取率的影响。当改变提取温度时，分别测定总黄酮提取率。结果见表6。表6  提取温度对桔皮总黄酮提取率的影响（略）
       由表6看出，开始时随提取温度的增加，桔皮总黄酮提取率增加，80 ℃时提取率最高；之后随提取温度的增加，总黄酮提取率呈下降趋势。选择提取温度为80 ℃。
       2.4  微波-超声辅助提取桔皮总黄酮工艺参数的优化在单因素实验的基础上，结合药材性质以及实际生产要求，以提取时间、乙醇浓度、料液比、提取温度为考察因素，以桔皮中总黄酮的提取率为评价指标，采用正交实验探索最优化条件。因素水平见表7，正交实验结果见表8。表7  正交实验因素水平，表8  正交实验因素水平（略）。
       
       由表8的分析可知：各因素对桔皮总黄酮提取率的影响程度不同，其影响的主次顺序为A＞B＞C＞D，即提取时间＞乙醇浓度＞料液比＞提取温度。由数据可以得出：提取时间为显著影响因素，极差分析最优组合应为A2B2C2D2 (即提取时间60   min、乙醇浓度φ=60 %、料液比1∶40、提取温度80 ℃)。
       
       为验证所优选工艺的可靠性和重复性，我们在桔皮中总黄酮提取的最佳工艺参数条件下，进行验证性实验，得出总黄酮的提取率为5.48 %，结果表明该工艺稳定可行。
       2.5  回收率实验称取1.0 g的桔皮粉末，精密称定6份，分别加入一定量的芦丁对照品25.00，25.00，50.00，50.00，75.00，75.00  mg，按照“2.2.2”项下实验方法提取，再按“2.2.3”项下方法进行实验。计算回收率。结果见表9。表9  回收率实验结果（略）
       3  讨论
          
       探讨了超声-微波协同辅助提取桔皮总黄酮的工艺条件，实验结果优于目前大量采用的热水提取，克服了热水提取时溶剂消耗大，提取率低的缺点。
       
       由于芦丁和黄酮类化合物的基本母核结构均为2-苯基色原酮，具有相同的吸光度测试性质，于510 nm处有最大吸收峰，因而可以采用芦丁为对照品来测定桔皮中总黄酮的含量。微波-超声协同辅助提取桔皮总黄酮的正交实验实验表明：因素提取时间的影响最大，其次为乙醇浓度、料液比，提取温度的影响最小。通过正交实验结果以及最优参数的验证实验，最佳提取工艺条件为A2B2C2D2 (即提取时间60 min、乙醇浓度φ=60 %、料液比1∶40、提取温度80 ℃)。本实验采用的微波-超声辅助提取桔皮中总黄酮技术是一种快速、简便、提取率高的提取方法。优选出的工艺操作简单、稳定性好。
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